Выделение белков — страница 7

распространены ионообменники, получаемые присоединением монотонных групп к целлюлозе, поперечно-сшитым декстранам (сефадексы). Для получения катионов в качестве ионогенной чаще всего используют карбоксильную группу рКа которой, несколько изменяющийся в зависимости от микроокружения, близок к 4 (карбоксиметил (СМ)-производные целлюлозы, сефадекса, содержащие группировки Карбоксильные группы таких ионитов отрицательно

заряжены при рН 5 и выше и, следовательно, способны связывать белки, которые в этих условиях несут положительный заряд. Связывание белков усиливается, если на их поверхности встречаются скопления ("гроздья") катионных групп. При прочих равных условиях с катионитом лучше связываются белки большей молекулярной массы, что объясняется кооперативностью многоточечного взаимодействия обширных участков поверхности такого

белка с анионными группами ионообменника. Десорбция белков, связанных катионитом, обычно достигается повышением ионной силы элюирующего раствора, причем взаимодействующие между собой заряженные группы белка и ионита оказываются в окружении противоположно заряженных ионов солей. В результате при определенной концентрации соли, характерной для каждого белка, электростатические взаимодействия между ним и ионитом снимаются

и белок элюируется с колонки. Плавное увеличение ионной силы раствора, применение линейного или более сложного градиента концентрации соли вызывает десорбцию сначала наиболее слабо удерживаемых молекул, затем более прочно связанных белков и т.д. В препаративных опытах нередко прибегают к ступенчатой элюции, при которой концентрации соли повышается скачками. Это ускоряет разделение и позволяет собрать белок в небольшом

объеме, однако легко приводит к образованию одним и тем же белком нескольких ложных. При промывании колонки с ионитом раствором соли подходящей концентрации белок десорбируется, иногда образуя довольно длинный "хвост", что может быть следствием неравномерного распределения ионных групп в сорбенте. Участки с их повышенным содержанием, скопления таких групп прочнее удерживают белок, что и вызывает задержку элюции и

образование "хвоста". В такой ситуации скачкообразное повышение ионной силы элюирующего раствора резко улучшает условия десорбции, поэтому часть белка, которая в обычных условиях образовывала бы "хвост", десорбируется скачком, давая ложный пик. Ввиду этого следует определять белковый состав каждой фракции независимым методом, например электрофорезом в полиакриламидном геле, или подвергать сомнительные пики