Выделение белков — страница 4

ферментов взаимодействовать со своим специфическим субстратом, несравненно избирательнее, чем любой прием, базирующийся на разнице физико-химических свойств. Схемы выделения белков, использующие только один какой-либо принцип, редки, обычно различные подходы к фракционированию сочетаются и дополняют друг друга. Разделение белков по молекулярной массе. Гель-хроматография (гель-фильтрация) В этом методе используют

гранулированные гели поперечно-сшитых гидрофильных материалов, например декстрана (сефадекс, сефароза и их аналоги), полиакриламида (биогели и их аналоги), поливинилового спирта (тойоперл). Гранулы образованы трехмерной сеткой полимера, которая непроницаема для крупных молекул, частично проницаема для молекул промежуточного размера и хорошо проницаема для небольших молекул, солей и воды. В зависимости от среднего размера

ячейки полимерного геля и геометрии молекулы последней доступна большая или меньшая часть общего объема гранул геля. При движении раствора, содержащего белки и другие молекулы, по колонке, которая заполнена набухшими гранулами геля, компоненты смеси, проникшие в гель, задерживаются в нем. Таким образом, они отстают от более крупных молекул, которые не могут войти внутрь гранул и находятся только в омывающем их растворе. Не

будучи включенными в гель, крупные молекулы появляются в элюате, как только через колонку пройдет "свободный" объем раствора , равный объему раствора, заключенному между гранулами геля. Последний определяется плотностью упаковки и геометрией гранул. Для сферических частиц, в виде которых обычно и выпускаются материалы для гель-хроматографии, свободный объем составляет 30—35% общего объема колонки . Если размеры молекул

белка таковы, что они могут проникать в поры, составляющие некоторую часть объема гранул, то будет наблюдаться задержка элюции и белок появится в объеме Ve, связанном с коэффициентом доступности (долей объема гранул, доступной данному виду молекул) соотношением: где V, — полный объем колонки, за вычетом той его части, которая приходится на сам гель образующий полимер. Каждому белку в зависимости от размеров его молекулы

соответствует свое значение, на чем и основало разделение при гель-хроматографии. Понятно, что если объем элюции  близок к свободному объему , то стремится к нулю и разделения белков, молекулы которых практически не входят в поры геля, не произойдет. Точно так же молекулы небольших размеров, для которых проницаем весь объем геля (Ve близок к  и стремится к единице), в геле с данными характеристиками не разделятся. Наилучшее