Выделение белков — страница 2

резкого преобладания положительных зарядов, которое благоприятствует развертыванию компактной структуры. В щелочной среде при рH 10 и выше утрачиваются положительные заряды, обусловленные протонированием ε-аминогрупп лизина, и опять-таки наступает декомпенсация зарядов на поверхности, дестабилизирующая глобулу. Одновременно фенольные гидроксилы тех остатков тирозина, которые были скрыты внутри глобулы, получив

отрицательный заряд, стремятся выйти на поверхность, что также способствует денатурации белка. В еще более щелочных растворах происходят реакции, необратимо повреждающие белок, — отщепление серы от остатков цистеина и цистина, β-элиминирование фосфатных остатков в фосфопротеинах, отщепление полисахаридных цепей, присоединенных к остаткам серина в гликопротеинах. Образующиеся в результате этих реакций остатки непредельной

аминокислоты — дегидроаланина — присоединяются к близлежащим ε-аминогруппам лизина с образованием так называемого лизиноаланина — соединения, присутствие которого в кислотном гид-ролизате белка свидетельствует о глубоком повреждении его структуры. Причиной денатурации может стать применение органических растворителей, способных нарушить существенную для стабильности белка систему гидрофобных контактов внутри

глобулы. Надо также учитывать возможность денатурации белка на границе раздела фаз, В особенности при образовании пены. При выделении очень малых количеств белка, не редком в современной биохимии, следует считаться с потерями, вызываемыми его адсорбцией, часто необратимой, на поверхности стекла или полимерных материалов, особенно значительной на заключительных стадиях очистки. Особую опасность при выделении белков

представляют содержащиеся в исходном материале протеолитические ферменты, даже если они присутствуют в следовых количествах. Повреждение, которое приводит к образованию ложных множественных форм белка, а иногда и его глубокое расщепление становятся особенно вероятными, если схема выделения включает условия, приближающие белок к денатурации. Для предотвращения протеолиза необходимо уже на ранних стадиях очистки включать

операции, направленные на отделение протеиназ, прибавлять к смеси ингибиторы различных классов протеиназ. Очень важно проводить очистку белка быстро, что снижает опасность протеолиза и вероятность денатурации. Распространено мнение об особой нестабильности чистых белков. Действительно, содержащиеся в неочищенных препаратах посторонние белки в определенной мере защищают белок от денатурирующих воздействий и протеолиза.