Секвенирование (Генная инженерия) — страница 2

  • Просмотров 5473
  • Скачиваний 503
  • Размер файла 129
    Кб

Гилбер­том, основан на селективной химической модифика­ции различных типов гетероциклических оснований в составе ДНК с последующим расщеплением межнуклеотидных связей в модифицированных звеньях. Реакции селективной модификации по каждому типу гетероциклических оснований проводятся таким обра­зом, чтобы в каждой молекуле ДНК в среднем моди­фицировалось только одно звено данного типа. По­скольку все звенья данного типа в

составе молекулы эквивалентны и реагируют с модифицирующим агентом с одинаковыми скоростями, то в сумме каждое звено этого типа окажется частично модифициро­ванным. Дальнейшая обработка ДНК вторичным амином или щелочью приводит к отщеплению моди­фицированных гетероциклических оснований от цепи ДНК и разрыву полинуклеотидной цепи в местах от­щепления гетероциклов (рис. 1). Модификации подвергают ДНК, 32Р-меченные по

5'-концевому нуклеотидному звену. Радиоактивная метка вводится фосфорилированием с помощью 32Р-АТР и Т4-полинуклеотидкиназы. Таким образом, в результате химичес­кой деградации получается набор фрагментов ДНК различной длины. Длины этих фрагментов соответст­вуют положению мономерных звеньев того типа, ко­торый подвергался модификации. Концевая радиоак­тивная метка служит точкой отсчета при определении длины продуктов

химической деградации ДНК (рис. 2) Набор полученных фрагментов фракционируется электрофорезом в ПААГ, который позволяет разде­лять олиго (поли) нуклеотиды, отличающиеся по длине всего на одно мономерное звено. Последовательность нуклеотидов в ДНК читается непосредственно с ра­диоавтографа геля. Метод Максама и Гилберта, разработанный для анализа первичной структуры достаточно длинных ДНК, применим и для коротких (8 – 16

звенных) оли-годезоксирибонуклеотидов. Однако в этом случае ре­акции химической модификации проводят в более жестких условиях (увеличивая время и температуру реакции) с целью повышения степени модификации. Рисунок SEQ Рисунок \* ARABIC 1 Рисунок SEQ Рисунок \* ARABIC 2 Набор реакций, применяемых для расщепления ДНК по мономерным звеньям определенного типа достаточно велик и постоянно пополняется: по остаткам гуанина – обработка

диметилсульфатом (рис. 3); по остаткам аденина и гуанина – апуринизация 50%-ной муравьиной кислотой (по Бартону); по остаткам аденина и цитозина – расщепление гетероциклических оснований под действием 1,2 н. гидроксида натрия и по остаткам тимидина и цитозина – обработка гидразином (рис. 4). В настоящее время широко используются два основных варианта секвенирования по Максаму — Гилберту. В первом из них реакции химической