рДНК-биотехнология. Способы биотрансформации клеток — страница 7

  • Просмотров 2521
  • Скачиваний 13
  • Размер файла 103
    Кб

вариант – элюировать каждый фрагмент, образующийся в результате расщепления одной рестриктазой, а затем обработать его второй. Смесь фрагментов, полученных после такой обработки, также анализируют с помощью электрофореза. В нашем примере были получены следующие результаты: Обработка каждого из 4-х А-фрагментов рестриктазой В 2100 - 1900 и 200, 1400 - 800 и 600, 1000 - 1000 (изменений нет) 500 - 500 (изменений нет) Обработка каждого из 3-х В-фрагментов

рестриктазой А 2500 - 1900 и 600 1300 - 800 и 500 1200 - 1000 и 200 Анализ полученных результатов показывает, что каждый из ферментов, полученный при расщеплении А-фрагментов рестриктазой В можно обнаружить в образцах, полученных при расщеплении В-фрагментов рестриктазой А. Ключом к рестрикционному картированию являются перекрывающиеся фрагменты. Такими в рассматриваемом примере являются В-фрагмент 2100 и А-фрагмент 2500. При обработке другой

рестриктазой они дают фрагмент 1900. Из данных о расщеплении этих фрагментов мы предполагаем, что с одной стороны на расстоянии 200 п. н. от фрагмента 1900 находится следующий А-сайт, а с другого конца, на расстоянии 600 п. н. – следующий В-сайт (рис. 38). При обработке двумя эндонуклеазами фрагмент 200 п. н. образуется 1 раз, при обработке рестриктазой А из В-фрагмента 1200, т. е. фрагмент 1200 лежит слева. Остается определить, как продолжается карта

вправо. Очевидно, это А-фрагмент 1400, так как он рассечен рестриктазой В на фрагменты 600 и 800. Вправо от фрагмента 2500 следует отложить, очевидно, фрагмент 1300. Тогда логично наличие А-фрагмента 500 и деления В-фрагмента 1300 рестриктазой А на 800 и 500. При построении рестрикционных карт обычно используют несколько рестриктаз, поэтому приходится анализировать сложные соотношения между фрагментами, полученными при действии разных

ферментов. Для упрощения процедуры картирования можно применять неполное расщепление. В определенных условиях рестриктаза узнает и расщепляет не все сайты в молекуле ДНК. Например, при частичном расщеплении ДНК ферментом А могут образовываться фрагменты 3100 п. н., 1400 п. н. и 500 п. н. Сопоставив их с данными полного расщепления (2100, 1400, 1000 и 500), можно сразу поставить рядом 2100 и 1000 (фрагмент 3100). А получив фрагмент 3500 – расположить рядом

2100 п. н. и 1400 п. н. Рис. 2. Анализ фрагментов рестрикции и карта фрагмента ДНК Другой прием – введение радиоактивной концевой метки. Концевые фрагменты определяются в этом случае по включению метки. Можно также сопоставить фрагменты путем гибридизации нуклеиновых кислот. Перекрывающиеся фрагменты (в данном случае 2100 и 2500) будут гибридизоваться. Первая карта была получена для вируса SV40 (обезьяний вирус, вызывающий злокачественную