Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 5

  • Просмотров 1579
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

является наиболее предпочтительным в свете повышения специфичности анализа. Однако к недостаткам зондов относится высокая стоимость, что делает работу по подбору зондов, праймеров и условий амплификации дорогостоящей. Вместе с тем, использование интеркалирующих агентов является очень простым и дешевым. Отпадает необходимость подбора специальных праймеров, зондов, так как можно пользоваться уже используемыми праймерами,

эффективность работы которых уже проверена. Эти обстоятельства делают применение интеркалирующих агеннтов весьма привлекательным. 1.1.2 Кинетические параметры Кинетическая кривая. Флуоресцентные красители обеспечивают флуоресценцию, прямо пропорциональную количеству ПЦР-продукта - репортерную флуоресценцию. Механизмы генерации репортерной флуоресценции различаются в зависимости от типа real-time PCR. Кинетическая кривая PCR в

координатах "Уровень репортерной флуоресценции — цикл амплификации" имеет сигмоидную форму (Рис. 5). Рис 5. Пример кинетических кривых RealTime PCR (по материалам www.molbiol.ru). В ней можно выделить три стадии: Стадию инициации (когда PCR-продукты еще не детектируется флуоресцентной меткой). Экспоненциальную стадию (в которой наблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от цикла PCR). Плато (стадию насыщения).

Экспоненциальная стадия PCR описывается уравнением: Pn = P0 * E n (1) ( www.molbiol.ru), где Pn - количество молекул продукта/репортерной флуоресценции к циклу n, P0 - исходное количество молекул, содержащих амплифицируемый фрагмент (template), E - эффективность амплификации. В идеальных условиях E = 2, т.е. на каждом цикле цепной реакции происходит удвоение количества продукта. Прологарифмируем обе части уравнения 1 и преобразуем его к виду: n = - (1/log E) * log P0

+ log Pn/log E (2) ( www.molbiol.ru) Назовем пороговым циклом (threshold cycle, C(T)) такой цикл n, на котором достигается некий заданный уровень репортерной флуоресценции - пороговая флуоресценция PC(T)=const. Для n=C(T) уравнение 2 принимает вид: C(T) = - (1/log E) * log P0 + log PC(T)/log E (3) ( www.molbiol.ru), т.е. значение С(T) прямо пропорционально логарифму количества субстрата (по материалам www.molbiol.ru).. Таким образом, real-time PCR позволяет сравнивать количества субстрата при условии, что

эффективность реакции и заданный уровень пороговой флуоресценции одинаковы для каждой из сравниваемых реакций [19]. Базовый уровень флуоресценции. Это тот уровень флуоресценции, который наблюдается в реакционной смеси до появления репортерного сигнала. Как правило, управляющие программы real-time PCR позволяют задать базовый уровень несколькими способами. Необходимо выбрать такой способ, при котором: Обеспечивается минимальный