Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 4

  • Просмотров 1605
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

концевыми последовательностями (molecular beacons). Данная методика отличается от описанной выше тем, что концевые последовательности зонда представляют собой взаимно комплементарные области, поэтому при температуре отжига праймеров они схлопываются и образуют шпильки [16](Рис. 2). Внутренняя область зондов содержит нуклеотидную последовательность, комплементарную амплифицируемой области. При отжиге праймеров зонды, не

присоединившиеся к ДНК матрице, остаются в "схлопнутом" состоянии, так что происходит тушение флуоресценции. Те же зонды, которые отжигаются на матрицу, разворачиваются, и флуоресцентная метка и гаситель расходятся в разные стороны. Таким образом, увеличивается интенсивность свечения. Системы ПЦР в реальном времени, основанные на Использовании зондов с комплементарными концевыми последовательностями, обладают гораздо

большей специфичностью чем система TaqMan, и позволяет обнаруживать одиночные замены нуклеотидов в ДНК. [8] Применение 2-х зондов с резонансным переносом энергии (Fluorescent resonance energy transfer - FRET). Данный способ детекции накопления продуктов амплификации отличается повышенной специфичностью, так как увеличение флуоресценции происходит при комплементарном связывании с ампликонами сразу 2-х ДНК зондов [11] (Рис 3). Принцип метода заключается

в переносе энергии от одного флуорофора, находящегося на 3` конце первого зонда, ко второму флуорофору, находящемуся на 5` конце второго зонда, причем расстояние между флуорофорами составляет 1-3 нуклеотида. Рис. 3. Схема ПЦР в реальном времени с использованием зондов FRET [7]. При одновременном связывании обоих зондов с ДНК матрицей испускаемое первым флуорофором излучение передается на второй флуорофор, а его излучение

детектируется прибором. Таким образом, возрастает специфичность анализа. Использование интеркалирующих агентов. Этот способ детекции основан на том факте, что флуоресценция бромистого этидия и SYBR Green I значительно возрастает при их внедрении в двухцепочечные молекулы ДНК [14] (Рис. 4). Таким образом, можно наблюдать за накоплением продуктов амплификации. Очень важно отметить то, что увеличение флуоресценции может быть связано

как с накоплением специфического продукта, так и неспецифического (праймеры-димеры, шмер). Для получения корректных результатов необходимо дополнительное изучение полученных ампликонов с помощью построения так называемых "кривых плавления". Рис. 4. Схема ПЦР в реальном времени с использованием интеркалирующих красителей [7]. Подводя итоги, стоит отметить следующее: использование ДНК-зондов в том или ином варианте