Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 18

  • Просмотров 1641
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

испускаемого им света. Светодиодная матрица состоит из нескольких источников света, длина волны которого соответствует спектру возбуждения красителя. На рисунке это изображено синими стрелками. Зелеными показана эмиссия. Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Определение зависимости сигнала флуоресценции от концентрации ДНК Готовили разведение матрицы с концентрациями 7, 3.5, 1.75, 0.875 и 0.219 нг. К растворам ДНК добавляли одинаковое

количество красителя SYBRgreen согласно протоколу описанному в пункте 2.3.1. Образцы объемом 1 мкл помещали в лунки планшетов. Измерение и регистрацию флуоресцентного сигнала проводили с помощью описанной системы детекции и программы «Qwantа». Результаты измерений представлены в таблице 2 и рис. 16. Таблица 2 Концентрация ДНК (нг) Флуоресцентный сигнал (у.е.) Измерение Отклонение 7 180 +/-15 3,5 170 +/-13 1,75 142 +/-11 0,875 63 +/-7 0,437 41 +/-4 0,219 21 +/-2 0 17 +/-2 На

графике (рис. 16) видно, что зависимость сигнала флуоресценции от концентрации ДНК имеет некую кривую. Разброс значений по мере роста концентрации ДНК увеличивается. Рис 16. График зависимости флуоресцентного сигнала от концентрации ДНК. 3.2. Проведение ПЦР в разных объемах смеси в пробирках Перед проведением реакции в микроплашках ПЦР провели в пробирках Eppendorf с общим объемом смеси 5, 4, 3, 2 и 1 мкл (исходная концентрация ДНК – 7 нг) в

среде масла. Подобная модель миниатюризации реакции может дать ответ на вопрос в каком минимальном объеме возможно прохождение амплификации и насколько эффективно. Данные о приросте сигнала флуоресценции будут своеобразным контролем для реакции смеси соответствующего объема в изготовленных микропланшетах. ПЦР-смесь заливали минеральным маслом объемом 10 мкл. В результате получали капельки образца в среде масла (рис. 17 А).

Рис. 17. Пробирки с разным объемом ПЦР смеси в среде минерального масла. А – схематическое изображение. Б – реальное изображение капли в объективе камеры. В качестве контроля служила смесь без матрицы в соответствующих объемах. Амплификацию проводили в амплификаторе «Терцик» производства «ДНК-технология». Реакцию ставили с использованием зондов SYBRgreen и TaqMan по протоколам описанным в пункте 2.3.2 и 2.3.3 соответственно. После

амплификации из каждой пробы отбирали по 1 мкл на измерения в стрипах. Тем самым измеряли флуоресценцию в одинаковых объемах. По результатам этих измерений судили об эффективности амплификации в каждой капле. Результаты детектировали на описанном выше оборудовании в пробирках и в перенесенных в микропланшетах (объем анализируемой смеси одинаков во всех пяти случаях – 1 мкл) (рис. 18.). А Б Рис 18. Лунка микропланшета с образцом