Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 17

  • Просмотров 1643
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

цикл 95о С 20 сек 40 циклов 62о С 20 сек 72 о С 40 сек и по окончании нужного количества циклов 72 о С 40 сек 2.4 Электрофоретическое разделение нуклеиновых кислот в 8% ПААГ Для приготовления геля было использовано. gels 1 2 H2O (мл) 3,7 7,4 30%АА/bAA (29:1) (мл) 1,87 3,74 5х ТВЕ (мл) 1,4 2,8 TEMED (мкл) 20 40 10% PSA (мкл) 27 54 Собирали кассету с вертикальными пластинками. В гель вносили полимеризаторы, перемешивали и заливали 4.2 мл между пластин. После полной полимеризации геля

между стекол вставляли гребенку. После полимеризации геля пластины извлекали из кассеты и помещали в камеру для электрофореза. Заливали электродный буфер следующего состава: 0,5 М ЭДТА, рН=8.0, 0,4 Borie Acid, 0,4 Tris. Извлекали гребенку из геля, не деформируя карманы. Пипеткой или шприцем промывали карманы от неполимеризовавшейся жидкости электродным буфером. Вносили ДНК пробы в карманы пипеткой, V=5 мкл. Подключали камеру к источнику тока.

Электрофорез проводили от минуса к плюсу при постоянной силе тока I=20мA на одну пластину, пока лидирующий краситель не выходил из геля (бромфеноловый синий), около 40 минут. 2.5. Система детекции результатов анализа После амплификации регистрацию флуоресцентного сигнала проводили на экспериментальной установке, собранной на базе бинокулярного микроскопа МБС-11 (Россия ) c телевизионным адаптором TV-A и камерой фирмы «Wateс» (Japan) WAT-120 N.

Сигнал с камеры подавался на плату видеозахвата «PixelView CX 881 P», находящийся на шине IDE персонального компьютера типа IBM PC. С помощью установки регистрировали сигнал (возбуждение – 470 нм, эмиссия – 520 нм), обрабатывали с помощью программы «Qwantа» (оригинальная разработка лаборатории). Он поделен на 4 части. Первая –Capture window – это онлайн окно, в поле которого проэцируется изображение лунки с образцом. Левое темное поле – это поле

захвата изображения. Здесь с помощью настроек можно указывать расположение области измерения, границы которого обозначены зеленой окружностью, устанавливать размер и сохранять изображение. Нижние поля – «расчетные данные эксперимента» и «измерения в текущем кластере» дают возможность снимать показания измерений и манипулировать их расчетами. Программа так же позволяет снимать запоминать и обрабатывать показания

флуоресценции не только с одного, как показано на рисунке, но и с нескольких рядов лунок с образцами. Оборудование состоит из двух корпусов. Корпус номер 2 имеет предметный столик, куда кладется анализируемый чип. На корпусе 1 закреплены светодиодная матрица и цифровая ТV-камера. Обьектив камеры имеет съемные оптические фильтры. При анализе образцов с SYBRgreen использовали зеленый светофильтр, соответствующий длинне волны