Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 16

  • Просмотров 1640
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

кривая получена при возбуждении образца длинной волны 470 нм. 2.3. Протоколы полимеразной цепной реакции: 2.3.1. Постановка реакции с использованием фирменного набора(система SYBgreen) Для ПЦР в качестве матрицы использовали плазмиду pcDNA3 cavmut – плазмидный вектор, содержащий кДНК мутантного кавеолина (P132L) человека (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1(исх.конц. 31 мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen (10000 кратный раствор) и

taq-полимеразу. Фермент поставляется фирмой Sigma в наборе c буфером в лиофильном состоянии в комплекте с растворителем. Кит рассчитан на общий объем смеси 20 мкл. Амлифицировался участок (фрагмент) размером около 650 п.н. Постановка ПЦР: 7 нг матрицы, 0,2мкМ pc1, 0,2мкМ pc2, деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 10 мкл, 10мкл растворителя, 0,2мкл SYBRgreen (разведенного в 100 раз). Для эксперимента использовались микропланшеты собственного

изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл): 94о С 120 сек 1 цикл 94о 20 сек 30 циклов 60о 20 сек 72 о С 40 сек и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек 2.3.2. Постановка реакции без использования фирменного набора(система SYBRgreen) В качестве матрицы

использовали плазмиду pcDNA3 cavmut (исходная концентрация 0,7 мг/мл), пару праймеров pc1 (исх.конц. 31мкМ) и pc2 (исх.конц. 12 мкМ), SYBRgreen и комплекс фермента (taq-полимераза) с антителами – так называемый Hotstart, 10-кратный сток буфера, растворы dNTP и MgCl2. Связывание полимеразы с антителами нужен для того, чтобы фермент начинал свою работу только при высоких температурах (первая температура каждого цикла реакции – 94оС), а при комнатной оставался

неактивным. Общий объем смеси 20 мкл. Амлификации поддавался участок размером около 650 п.н. Постановка ПЦР: 7 нг матрицы, 0,2 мкМ pc1, 0,2 мкМ pc2, деионизированная (milliQ) дистиллированная вода до 14 мкл, 2 мкл SYBRgreen, 2 мкл буфера (сток х 10), 2 мкл 2мМ MgCl2, 0,2 мкл taq-полимеразы (5Е/мл), 0,4 мкл 0,2мМ dNTP (нуклеотидтрифосфоты). Для эксперимента использовались микропланшеты собственного изготовления. В качестве контроля служила лунка с ПЦР-ной смесью без

матрицы. Для отработки условий ПЦР в микрообъеме проводили 30 циклов. Регистрацию флуоресценции проводили по конечной точке. Температурный режим (1 цикл): 94о С 120 сек 1 цикл 94о 20 сек 30 циклов 60о 20 сек 72 о С 40 сек и по окончании нужного количества циклов 72 о С 120 сек 2.3.3. Протокол полимеразной цепной реакции с использованием TaqMan. На одну пробу объемом 20 мкл смешивают: 8,75 мкл смеси А, 8,75 мкл смеси Б, 0,2 мкл Taq-полимеразы, 2 мкл ДНК. 95о С 5 мин 1