Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 15

  • Просмотров 1659
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

двухцепочечной ДНК для SYBR Green составляет 1-2 нанограмма для коротких синтетических олигонуклеотидов и до 20 пикограмм высокомолекулярной природной ДНК. SYBR Green I обладает существенно высокой специфичностью в отношении ДНК-дуплекса и является более безопасным по сравнению с другими красителями – он не оказывает высокого уровня мутагенного действия. Методика Достоинства Недостатки SYBR Green Значительно дешевле собрать новую

реакцию, т.к. достаточно лишь заказать новые праймеры. Невозможность работать больше, чем с одной PCR-реакцией в одной реакционной смеси. Высокие требования к специфичности реакции - любая двуцепочечная ДНК, в том числе димеры праймеров, будет генерировать репортерную флуоресценцию. Меньшая точность при малых количествах субстрата. Окисление со временем TaqMan Возможность проведения нескольких количествленных реакций в одной

смеси. Меньшие требования к специфичности реакции: репортерная флуоресценция будет генерироваться только при гибридизации пробы со специфическим PCR-продуктом. Бóльшая точность при малых количествах субстрата. Дороговизна. Новый зонд (около $200) для каждой реакции. Меньше возможностей для оптимизации (если реакция не пошла с данной комбинацией зонда и праймеров, то, скорее всего, придется заказывать новый зонд и новые праймеры).

Данные о флуоресценции: максимум флуоресценции в комплексе с ДНК составляет 521 нм, максимум возбуждения - 497 нм (второй максимум около 254 нм). Хорошо возбуждается стандартным 488-нм лазером. Квантовый выход флуоресценции - около 0.8 (что в 5 раз превышает квантовый выход комплекса этидий-ДНК). Обычно SYBR Green хорошо работает примерно до C(T) = 35-37, затем точность начинает падать. Диапазон достоверности результатов легко проверить для каждой

конкретной пары праймеров, проведя несколько независимых real-time PCR. В системе TaqMan использовали зонд, меченный красителем FAM и имеющий следующую последовательность: 5’(FAM) – СTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG – (TAMRA) – 3’. Длина 33 нуклеотида. Молекулярный вес 10137. Длина волны возбуждения FAM 470 нм, длина волны эмиссии 525 нм. Перед работой определяли спектр поглощения и испускания света интеркалятора на приборе Perkin Elmer MPF-44-B Fluorescence Spectrophotometer.

Результаты измерений представлены на рис. 13. Рис. 13. График зависимости сигнала фотодетектора от длины волны. На рисунке синей кривой показан спектр поглощения света красителем. Кривая получена при эмисии образца 520нм. Видно что SYBR поглощает свет длинной 260нм (первый пик). Второй пик приходится на 470 и 495 нм. Зеленая кривая показывает спектр испускания длины волны. Согласно ей, интеркалятор испускает свет с длиной волны 520 нм. Эта