Разработка условий оптимизации процесса амплификации ДНК — страница 14

  • Просмотров 1660
  • Скачиваний 28
  • Размер файла 245
    Кб

Изготовление микропланшетов Для эксперимента были изготовлены пластины размером 50х50 мм с рабочей зоной 20х20 мм с различным количеством лунок (до 91 шт). При изготовлении планшетов мы руководствовались размером термокамер в экспериментальном образце амплификотора, поэтому такие их длина и ширина являются оптимальными. Схема амплификатора представлена на рис. 10. Материал, из которого должны быть изготовлены плашки должен

обладать следующими свойствами: термостойкость (материал должен выдерживать минимум 95 С-самая высокая температура в цикле); прочность (не должен подвергаться деформации даже при незначительных механических воздействиях); химическая инертность (материал не должен взаимодействовать с компонентами ПЦР смеси); дешевизна(материал должен быть не дорогим и доступным). Экспериментально был подобран материал, который обладает всеми

вышеперечисленными качествами – это полимерная пленка Aikor DecoDesign Black (производство Германия). Изготовление плашек делали путем термоформовки на металлической матрице с помощью металлического пуансона-позиционера как показано на рис 11. В результате получали планшеты с лунками объем которых бал равен 1,5 мм3. 2.2 Определение спектра поглощения и эмисии SYBRgreen В RealTimeПЦР используют как описано выше несколько видов зондов. В своих

исследованиях мы использовали SYBR Green. При выборе зондов мы руководствовались несколькими параметрами, в том числе стоимость, совместимость с системой детекции и т.д. Технологии Molecular beacons и LightCycler стоят ощутимо дорого, и их осмысленно применять лишь в том случае, когда требуется крайне специфичная детекция лишь одного из образующихся PCR-продуктов (например, при анализе SNP). Методики SYBR Green и TaqMan стоят дешевле, однако каждый из них

имеет свои особенности. В таблице 1, приведенной ниже, сравниваются методики SYBR Green и TaqMan. В наших исследованиях мы использовали эти системы. Они активно используются в RealTimeПЦР для определения количественных параметров ПЦР непосредственно в ходе реакции. Однако мы для решения поставленных задач пользовались этими методиками для детекции сигнала по конечной точке. В своей работе мы использовали флуоресцентный интеркалирующий

краситель SYBRgreen (10000 кратный сток производства фирмы «ДНК-синтез») и набор компонентов для проведения ПЦР с использованием TaqMan, синтезированных компанией «Синтол» (наработанный продукт амплификации имеет размер около 100 п.н.). Краситель SYBR Green - исключительно чувствительный флуоресцентный индикатор двухцепочечной ДНК. Применяется для realtime-PCR, а также для прокраски гелей (как агарозных, так и полиакриламидных). Предел обнаружения