Прыжки по хромосоме — страница 9

  • Просмотров 1053
  • Скачиваний 14
  • Размер файла 205
    Кб

можно лигировать и производить селекцию сцепленных фрагментов. Для селекции геномные фрагменты встраивают в фаговый вектор, несущий амбермутации по крайней мере двух генов белковой оболочки, упаковывают фаговую ДНК in vitro и инфицируют клетки бактерии-хозяина, лишенные функции supF. Формировать бляшки на таком газоне могут только те фаговые частицы, геномы которых содержат собственные supF-гены. Теоретически подходит любой

фаговый вектор, несущий амбер-мутации и клонирующий сайт. Желательно, конечно, чтобы этот вектор обеспечивал максимальную клонирующую емкость. Идеальной можно считать ситуацию, когда кольцевые геномные фрагменты расщеплялись бы лишь частично мелкощепящим ферментом, а затем лигировались в вектор большой емкости, чтобы не было дискриминации фрагментов, обусловленной расположением сайтов рестрикции. Однако обязательные

потери, происходящие при частичном расщеплении, оказываются препятствием на пути создания полной библиотеки. Имеющиеся у нас в настоящее время стандартные геномные библиотеки для «прыжков по хромосоме» были получены в результате полного расщепления кольцевых геномных фрагментов рестриктазой EcoRl. Можно использовать и другие ферменты, для которых имеются амбермутантные фаговые клонирующие векторы. 2.6 Анализ клонов После

очистки бляшек можно приготовить минилизат ДНК из клонов, руководствуясь любой стандартной методикой. Использование на этой стадии в качестве газона LE392 позволяет получить несколько больший выход фаговой ДНК, чем при посеве на МС1061. Обработка рестриктазой ЈcoRI позволит определить размер инсерционного фрагмента. Если в данном клоне имеется более одного fcoRI-фрагмента, это значит, что при клонировании в один вектор были

лигированы две вставки. В таком случае следует провести блот-гибридизацию данного клона с исходным зондом и с supF, чтобы определить, находятся ли эти вставки в одном EcoRI-фрагменте или в разных. В первом случае с клоном можно продолжать работать дальше традиционными методами; во втором случае он не представляет ценности для дальнейших исследований. ZTcoRI-фрагмент полезно переклонировать в плазмиду, чтобы упростить работу по его

изучению. Субклоны можно легко идентифицировать, благодаря наличию SHpF-маркера. Рестрицированный минилизат ДНК можно лигировать в pBR322, предварительно обработанную ЈcoRI и фосфатазой, и полученной рекомбинантной ДНК трансформировать штамм бактерии-хозяина, несущий какую-либо амбермутацию в lacZ, например CARD-15. Высев культуры на агар Мак-Конки с ампициллином позволяет практически сразу выявить интересующие колонии, так как они