Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование — страница 5

  • Просмотров 1371
  • Скачиваний 11
  • Размер файла 81
    Кб

образуется набор радиоактивно меченных одиночных цепей всех возможных длин - от единицы до п, где п - полная длина секвенируемой молекулы. В обоих подходах, химическом и ферментативном, полный набор фрагментов на самом деле бывает представлен в виде четырех отдельных наборов. В идеале каждый такой набор содержит все возможные фрагменты, берущие начало на одном конце цепи и продолжающиеся до очередного местоположения

определенного нуклеотида. Так, один из наборов содержит все возможные цепи, начинающиеся в одном сайте и оканчивающиеся в тех местах, где встречается дезоксиаденозин. Второй набор содержит все возможные цепи, начинающиеся в том же сайте, а заканчивающиеся на всех встречающихся поочередно дезоксицитидиновых остатках. Третий и четвертый наборы представлены фрагментами, оканчивающимися на остатках тимидина или

дезоксигуанозина. Химический и ферментативный методы отличаются друг от друга способом получения четырех наборов фрагментов. В первом случае этот набор получают путем разрезания предварительно радиоактивно меченной цепи четырьмя разными способами, а во втором четыре радиоактивно меченных набора фрагментов получают путем копирования немеченой цепи ДНК. Последним этапом в обоих методах является разделение фрагментов,

составляющих каждый из наборов, по длинам с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. При этом удается разделить полинуклеотидные цепи, отличающиеся друг от друга только одним нуклеотидным остатком. Поскольку фрагменты несут радиоактивную метку, их легко выявить с помощью радиоавтографии, при этом достаточно лишь небольшого количества ДНК - порядка пикомолей или даже меньше. Все четыре набора,

полученные из одного фрагмента ДНК, подвергают одновременному электрофорезу на параллельных дорожках одной пластины геля. Сканируя каждую дорожку, расшифровывают всю последовательность. Используя специальные электрофоретические методы, можно разделить цепи размером от 1 до 300 или более нуклеотидных остатков. Молекулы, длина которых превышает несколько сотен нуклеотидов, фрагментируют и затем определяют нуклеотидную

последовательность каждого фрагмента. б. Химическое секвенирование Получение наборов фрагментов, имеющих общие концы. Химическое секвенирование основано на специфической модификации различных пуриновых и пиримидиновых оснований. Эти модифицированные основания выщепляют затем из полимерной цепи с сохранением сахарофосфатного остова. Далее гидролизуют относительно нестабильные фосфодиэфирные связи, соседствующие с