Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование

  • Просмотров 1354
  • Скачиваний 11
  • Размер файла 81
    Кб

Продукты рекомбинации: характеристика и манипулирование После отбора клонированных рекомбинантных молекул нужно охарактеризовать содержащуюся в них вставку. Для этого необходимо ответить на несколько вопросов. Прежде всего - действительно ли рекомбинантная молекула содержит нужный сегмент ДНК? Далее - включился ли сегмент целиком или только частично? Соответствует ли он во всех деталях геномной ДНК, из которой

происходит? Является ли нужная последовательность функциональной? Мы рассмотрим разные подходы к характеризации клонированных фрагментов ДНК. Прежде всего нужно очистить рекомбинантную ДНК от ДНК клеток хозяина, РНК и белков. Эта процедура довольно проста и включает экстракцию, физическое разделение компонентов и ферментативное расщепление РНК и белков. Так, плазмидную ДНК можно отделить от геномной благодаря ее малому

размеру и кольцевой структуре. Фаговую ДНК можно получить в свободном от клеточной ДНК виде путем очистки фаговых частиц и последующего выделения из них ДНК. макроструктура клонированной вставки Для определения макроструктуры вставки сначала устанавливают ее размер и положение сайтов для рестриктирующих эндонуклеаз. Поскольку клонированные фрагменты геномной ДНК часто бывают длиннее или короче, чем интересующая нас

область, необходимо также определить положение и длину нужного сегмента внутри вставки. а. Размер вставки Размер векторной молекулы обычно бывает известен, поэтому размер вставки можно оценить, зная полную длину рекомбинантной молекулы и предположив, что никакого делетирования во время клонирования не произошло. Размер многих рекомбинантных молекул можно определить с помощью гель-электрофореза. Чтобы получить точные

данные, кольцевые рекомбинантные молекулы превращают в линейные, поскольку электрофоретическая подвижность кольцевых структур зависит от степени их сверхспиральности. Стандартные электрофоретические методы непригодны для тестирования молекул, длина которых превышает 15 т.п. н, поскольку крупные молекулы мигрируют в геле слишком медленно. Поэтому размер многих рекомбинантных молекул не поддается прямому определению с