Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике — страница 9

  • Просмотров 28685
  • Скачиваний 1576
  • Размер файла 671
    Кб

длительные и трудоемкие этапы анализа. Промывание проб может произ­водиться в автоматическом режиме с помощью специального прибора – вошера или вручную, многоканальной пипеткой. Для проведения ИФА необходимы: – полистироловый планшет или другие использующиеся варианты твердой фазы; – отмывающий раствор; – конъюгат (меченные ферментной меткой антигены или антитела); – смесь используемых субстратов; –

останавливающий раствор (Стоп-реагент – раствор для останавливания ре­акции); – образцы, использующиеся для положительного и/или отрицательного кон­троля; – стандартный антиген (для построения калибровочной кривой); – одно- и многоканальные пипетки; – вошер (промыватель); – оптический прибор для определения оптической плотности исследуемого раствора (ИФА-ридер, считыватель, который последовательно

фотометрирует все лунки); – 5-100 мкл исследуемого биологическою материала. Прямой ИФА 1. В лунках панелей адсорбируют антигены или антитела (исследуемый ма­териал). Выше отмечалось, что антигены существенно различаются по способ­ности адсорбироваться на разных видах пластика в зависимости от того, к како­му классу веществ (белкам, углеводам или липопротеинам) они принадлежат. Часто в прямом ИФА антиген, иммобилизованный

на твердой фазе, это клетки и другие корпускулярные антигены. Контроль. В качестве контроля используют лунки с адсорбированным положи­тельным контрольным образцом, в котором обязательно содержится искомый антиген, и отрицательным контрольным образцом заведомо не содержащим ис­следуемого антигена. При наличии очищенного стандартного антигена реакцию проводят в нескольких разведениях, так чтобы можно было построить

калибро­вочную кривую. 2. «Блокируют свободные места связывания, оставшиеся на твердой фазе, с помощью БСА казеина и др. (для предотвращения неспецифической сорбции конъюгата на твердой фазе). 3. В лунки вносят меченные ферментом антитела или антигены (конъюгат), инкубируют. Связывание конъюгата с твердой фазой будет происходить лишь в случае комплементарности обоих компонентов системы. После  инкубации с коньюгатом

лунки отмывают, удаляя, таким образом, не связавшуюся часть конъюгата. 4. Затем в лунки вносят субстрат, специфичный для используемого фермента, и инкубируют. По достижении оптимального уровня окрашивания в лунках с положительным контролем, ферментативную реакцию останавливают. 5. Учет реакции. Сначала результаты реакции учитывают визуально. Для бо­лее точного учета результатов интенсивность окрашивания оценивают на