Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике — страница 7

  • Просмотров 28692
  • Скачиваний 1576
  • Размер файла 671
    Кб

фермента на молекулу иммуноглобулина и сохраняющие высокую фер­ментативную и иммунологическую активность. Однако количество таких обра­зовавшихся конъюгатов невелико (для пероксидазы хрена составляет 5 - 10 %). Наибольшее практическое применение нашел метод получения иммунопероксидазных конъюгатов, основанный на окислении углеводного компонента фермента периодатом натрия (связывание пероксидазы в конъюгат достигает

70-90 % от начального количества фермента). Надежный конъюгат должен обладать следующими свойствами: - высоким антительным тигром и высокой афинностью к антигену, чтобы его можно было использовать в большом разведении, и таким образом, умень­шить неспецифическое связывание; -  достаточной специфичностью в рабочем разведении; - преобладанием мономерных форм над полимерными, т.к. полимерные фор­мы имеют тенденцию к

неспецифической адгезии на пластике, что приводит к высокому фоновому уровню реакции; - оптимальным молярным соотношением между ферментом и антителами (оптимальное соотношение составляет около 1:1); - достаточной ферментативной активностью конъюгата. Это свойство опреде­ляется главным образом условиями конъюгации и соотношением молекул фермента и антител в конъюгате. Твердая фаза В качестве твердой фазы для проведения ИФА

можно применять различ­ные материалы: полистирол, поливинилхлорид, полипропилен и другие вещест­ва. Твердой фазой могут служить стенки пробирки, 96-луночные и др. планше­ты, шарики, бусины, а также нитроцеллюлозные и другие мембраны, активно сорбирующие белки. Иммобилизация антигена или антител на твердой фазе возможна тремя путями: – пассивная адсорбция, основанная на сильных гидрофобных взаимодействиях между белками

и синтетической поверхностью; – ковалентное прикрепление к твердой фазе; – иммунохимическое и др. (нековалентное и неадсорбционное присоединение). Пассивная адсорбция белков широко используется при проведении ИФА на платах для титрования, на нитроцеллюлозных мембранах. Пассивная адсорб­ция идет по принципу насыщения и коррелирует с молекулярной массой адсор­бируемого вещества. Адсорбционная поверхность мембран

различного типа (нитроцеллюлоза, нейлон и др.) в 100-1000 раз выше, чем у пластика. Полисахариды и сильногликозилированные белки часто имеют низкую аффинность для полистирола. Необходимы другие методы для их иммобилиза­ции, например, ковалентное присоединение с помощью глутарового альдегида. Ковалентное присоединение эффективно, если в качестве твердой фазы исполь­зуются гидрофильные бусы (агароза) и полистироловые бусы.