Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике — страница 5

  • Просмотров 28696
  • Скачиваний 1576
  • Размер файла 671
    Кб

сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью. Субстраты. Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична. Основные требования к субстрату: – обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате; – образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат; – субстрат должен

быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.   Таблица 1. Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.   Фрмент Источник получения М.М. (кДа) Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм) Конъюгирующий реагент Пероксидаза хрена Хрен (Armoracia rusticana) 40 О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм) 5-аминосалициловая кислота      (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин. Глутаральдегид

Мета-периодат натрия N-сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат β-D-галак-тозидаза E. Coli 540 О-нитрофенил-β-D-галактозид (420 нм) Мета-малеимидобензол-N-гидроксисукцинимидный эфир Щелочная фосфотаза E. Coli, слизистая кишечника теленка 84-150 Р-нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4-хлоро-3-индолил фосфат Глутаральдегид   Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образу­ют окрашенное вещество. Перспективным является

использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка. Антигены и антитела. АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью

и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций. Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувст­вительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности ис­пользуемых антител. Используемые

антитела могут быть поли- или монокли­нальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чув­ствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых