Принципы иммуноферментного анализа, основные виды ИФА, применение в диагностике — страница 10

  • Просмотров 28687
  • Скачиваний 1576
  • Размер файла 671
    Кб

ИФА-ридере с соответствующим светофильтром. По результатам проведенного анализа строят график зависимости оптической плотносги от концетрации (рис. 2).         Рисунок 2. Прямой ИФА. а) для выявления антигена; б) для выявления антител.     Непрямой ИФА  Этот вариант ИФА используют обычно для выявления специфических антител. В лунках панелей адсорбируют стандартный антиген и инкубируют с образцами сыворотки или

другого биологического материала, полученного от больного (спинномозговая жидкость, слюна и др.). Специфические антитела, связавшиеся с антигеном на твердой фазе, выявляют с помощью антиглобулинового конъюгата. В зависимости от цели анализа используют разные антиглобулиновые реагенты, выявляющие антитела всех изотипов, либо специфичные к отдельным классам и подклассам иммуноглобулинов. Основное достоинство метода состоит

в универсальности конъюгата. Один и тот же коньюгат может служить для выявления антител человека к самым разным антигенам в любых образцах. Реакция методически проста. Основные этапы непрямого ИФА для определения антител: 1. Антиген адсорбируют на твердой фазе, затем отмывают от несвязавшихся компонентов. 2. Блокируют свободные месга связывания. Отмывают. 3. В лунки вносят исследуемый материал, инкубируют и затем проводят

проце­дуру отмывки. Параллельно ставят пробы с положительным и отрицательным контролями. 4. Добавляют антиглобулиновый конъюгат в рабочем разведении, инкубируют, отмывают от несвязавшихся компонентов. 5. Вносят субстрат, инкубируют. По достижении оптимального уровня окраши­вания в лунках с положительным контролем реакцию останавливают, добавляя стоп-раствор. 6. Измеряют количество продукта реакции на ИФА-ридере (рис.3). При

оптимальных условиях проведения анализа метод высокоспецифичен и чувствителен. Он позволяет выявлять нанограммовые количества антител в сы­воротках исследуемых больных. Для получения удовлетворительных результа­тов необходима стандартизация реагентов и методических приемов. Этот вари­ант ИФА может также использоваться для тестирования моноклональных антител. «Сэндвич» –  вариант ИФА для выявления

антигенов.  Антигены, определяемые с помощью данного варианта ИФА, должны иметь несколько эпитопов, способных связывать антитела, или обладать повто­ряющимися, пространственно разделенными эпитопами одинаковой специфич­ности. При проведении этого варианта ИФА высокоспецифичные поли- или моноклональные антитела, адсорбированные на твердой фазе, инкубируют с иссле­дуемым образцом. После процедуры отмывания в лунки