Принципы биохимических исследований — страница 4

для последующих биохимических исследований. С помощью препаративного центрифугирования выделяют большое количество клеточных частиц для изучения их морфологии, структуры и биологической активности. Метод применяется для выделения таких биологических макромолекул, как ДНК и белки, из предварительно очищенных препаратов. Аналитическое центрифугирование применяется главным образом для изучения чистых и практически чистых

препаратов макромолекул или частиц, например, рибосом. В данном случае используется небольшое количество материала, а седиментация исследуемых частиц непрерывно регистрируется с помощью специальных оптических систем. Метод позволяет получать данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала. В практике препаративное центрифугирование применяется гораздо чаще, чем аналитическое, поэтому мы остановимся на нем

более подробно, хотя в основе обоих методов лежат общие принципы. Лекция 3. Разделение белков путем осаждения Осаждение нуклеиновых кислот. Обычно, когда говорят о высаливании, имеют в виду высаливание именно сульфатом аммония. Этому методу уже более 130 лет. Раньше он применялся и для фракционирования, сейчас, в основном, как дешёвый и удобный метод осаждения белков. Можно считать, что повезло, если при этом получается ещё и

существенная очистка (при высаливании из клеточного экстракта можно рассчитывать на приблизительно 2-10 кратное обогащение). Почему именно сульфат аммония? При равной молярной концентрации поливалентные анионы долее эффективны для высаливания, чем моновалентные (отчасти из-за того, что имеет значение не концентрация соли, а ионная сила раствора), а поливалентные катионы даже препятствуют действию поливалентных анионов.

Получается, что оптимально сочетание - это поливалентный анион с моновалентными катионами. Эффективность высаливания убывает в серии Гофмейстера (Hofmeister): Цитрат > Сульфат > Фосфат > Хлорид > Нитрат > Тиоционат В этом же ряду убывает стабилизирующий эффект и возрастают хаотропные свойства соли. Таким образом, наиболее подходящие кандидаты: цитрат и сульфат. Сульфат более удобен из-за лучшей растворимости (например, при

нормальной температуре растворимость аммонийных солей цитрата и сульфата равны примерно 2.5М и 4.1М); низкой цены и стабилизирующего влияния, которое он оказывает на большинство белков при концентрациях выше 0.5М. (NH5) 2SO4 преципитируют белки по двум механизмам сульфат-ионы делают молекулу белка более компактной (менее растворимой) за счёт взаимодействия с положительно заряженными аминокислотами. Это взаимодействие более