Прикладные вопросы экологической генетики — страница 4

  • Просмотров 204
  • Скачиваний 10
  • Размер файла 30
    Кб

или рестриктазами. Эти ферменты обнаруженные в бактериях, способны разрезать ДНК, например они разрезают любую вторгающуюся в бактериальную клетку вирусную ДНК, ограничивая таким образом размножение вирусов внутри клетки. Разные виды бактерий продуцируют различные рестрекционные эндонулеазы. Кажда из них разрезает нуклеоновую кислоту (отсюда «нуклеаза») в строго определенных точках («эндо» означает, что фермент разрезает

молекулу изнутри, а не атакует ее с концов). Фермент распознает некую последовательность оснований и взаимодействий именно с ней. Точки разрезания называются сайтами рестрикции. К настоящему времени выделено более 2000 рестриктаз, активных в отношении 230 разных последовательностей. Свою собственную ДНК бактерия защищает путем присоединения к определенным основаниям в сайтах рестрикции метильной группы. Название каждого

фермента происходит от названия бактерии, из которой его выделяют. Рестрицируемая последовательность - мишень часто имеет шесть оснований в длину и является палиндромной, т.е. читается одинаково в обоих направлениях. Две комплементарные цепи ДНК считываются в противоположных направлениях. Некоторые рестриктазы производят ступенчатые надрезы. В результате их действия образуются фрагменты ДНК с выступающими одноцепочечными

концами. Такие концы называются «липкими»; их используют для воссоединения фрагментов ДНК. Они как бы слипаются за счет образования водородных связей с комплементарными липкими концами других молекул ДНК, разрезанных той же рестриктазой. При обработке ДНК донорного организма рестриктазами рассчитывают на то, что один из фрагментов будет случайным образом содержать полную копию нужного гена и ничего больше. Этап 2.

Встраивание генов в вектор Плазмидная ДНК Кольцевые молекулы плазмидной ДНК у бактерий гораздо меньше, чем основная хромосомная ДНК, поэтому их можно легко отделить друг от друга. Бактериальные клетки разрушают и центрифугируют. При этом хромосомная ДНК оказывается в осадке, а плазмидная ДНК остается в жидкой фазе над осадком. Перед обработкой рестриктазами плазмидную ДНК очищают. Фаговый вектор Преимуществом фагов как

векторов является возможность клонирования больших фрагментов ДНК по сравнению с теми, которые могут переносить плазмиды. Чаще других для этой цели используют фаг λ. Часть фаговой ДНК заменяют на ДНК, которую нужно клонировать. Эта часть не нужна для репликации фаговой ДНК в бактериальной клетке-хозяине, поэтому клонирование не нарушается. Этап 3.Введение вектора в хозяйскую клетку На данном этапе фаговый или плазмидный