Нокаут генов — страница 4

  • Просмотров 1100
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 157
    Кб

ген neo (МПС) сохранится, и в отобранном пуле ЭСК будут присутствовать рекомбинантные клетки, не несущие необходимых изменений. Эта проблема решается внесением в векторную конструкцию маркера отрицательной селекции (МОС). Им может служить ген тимидин-киназы простого вируса герпеса (HSV-tk) или ген дифтерийного токсина А (DT-A), продукты которых убивают эукариотические клетки. Положение МОС с наружной стороны гомологичного плеча

вектора позволяет элиминировать его после прохождения гомологичной рекомбинации (рис. 4). В случае же негомологичной рекомбинации, МОС оказывается интегрированным в геном трансформированной клетки, что приводит к ее элиминации. Наличие двух маркеров селекции (положительного и отрицательного) позволяет быстро и эффективно проводить отбор нужных трансформантов [23,19]. Рис. 4. Действие системы позитивной – негативной селекции: А)

интеграция вектора в нужный участок генома, приводящая к нокауту гена, Б) случайная интеграция (синтез тимидин-киназы и гибель клеток) [19]. 1.2 Внесение вектора в эмбриональные стволовые клетки Для трансформации используют эмбриональные стволовые клетки мышей. Помимо того, что культура ЭС клеток способна расти in vitro, при пересадке во взрослую мышь или эмбрион клетки имеют свойство приживаться. ЭС клетки, в отличие от

специализированных соматических клеток, сохраняют генетические потенции без тканевой специализации. Эти клетки имеют "минимальный" фенотип: минимум рецепторов и программ для взаимодействия с микроокружением, поскольку лишь 5% из 500 генов транссигнализации экспрессировано в пролиферирующих ЭСК. Второй важнейшей характеристикой ЭСК в культуре является практически неограниченный потенциал пролиферации, обусловленный

особенностями фенотипа незрелых клеток. Третьей особенностью ЭСК является рост суспензионными клонами без какой-либо примеси продвинутых клеток, прикрепленных к подложке. Каждый клон в такой культуре является производным одной прародительской ЭСК [1]. Эмбриональные стволовые клетки мыши впервые получены в 1981 году [8], что дало возможность для развития работ по инактивации генов. Внесение линеализированного вектора в ЭС

клетки возможно несколькими методами: микроинъекция, трансфекция (электропорация), трансдукция (вирусная инфекция). Перечисленные методы имеют свои преимущества и недостатки. Микроинъекция позволяет с частотой до 100 процентов вносить экзогенную ДНК в клетку, а частота гомологичной рекомбинации составляет около 0,67%. Этот метод, несомненно, является наиболее эффективным. Однако для осуществления микроинъекции требуется