Методы измерения ионных токов — страница 5

  • Просмотров 515
  • Скачиваний 16
  • Размер файла 119
    Кб

давления. Такая манипуляция в большинстве случаев не нарушает контакта пипетки с мембраной, и в результате между пипеткой и содержимым клетки устанавливается хорошо изолированный от омывающего раствора проводящий путь. Такой способ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений, чем введение стандартного микроэлектрода. Входное сопротивление небольших клеток велико по сравнению с эффективным сопротивлением

кончика пипетки, поэтому при работе с ними электрические измерения можно проводить от участка мембраны намного большей площади, чем у исходного фрагмента. В отличие от разных вариантов ПК регистрации этот метод позволяет осуществить регистрацию от мембраны целой клетки, а не от маленького мембранного фрагмента. Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим раствором с низкой концентрацией ионов

кальция. Пипетку прижимают к поверхности клеточной мембраны, в результате чего формируется высокоомный контакт. Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт. На этом этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты, обусловленной ёмкостью держателя и стенок пипетки. К пипетке прикладывают импульсы отрицательного давления до тех

пор, пока вновь не появятся ёмкостные переходные процессы (возникает дополнительный ток). Регистрацию от целой клетки можно проводить в течение часа без визуальных или электрических признаков нарушения мембраны. Если исследуемая клетка плотно прикрепилась к культуральной чашке, плавным отведением её от пипетки можно получить конфигурацию outside-out. После такой процедуры клеточная мембрана быстро “зашивается” и клетка

является интактной. Но содержимое клетки соответствует раствору в пипетке. Это используется в различных целях: для изменения содержимого выбранной клетки с минимальным повреждением её мембраны. Для проведения исследований с различными внутриклеточными растворами на одной и той же клетке путем смены регистрирующих пипеток. Для регистрации в одном эксперименте интегральных токов и одиночных каналов. Пипетки должны быть

сравнительно широкими и иметь кончики с большим углом схождения. Между раствором в пипетке и содержимым клетки происходит быстрый обмен, поэтому раствор для заполнения пипеток должен быть близок по своему составу к клеточному содержимому. Таб. 2. Типичные электрические параметры, получаемые при регистрации на хромафинных клетках в конфигурации РЦК Последовательное сопротивление, Rs 4 МОм Ёмкость клетки, C 5 пФ Пост. Времени