Методы генной инженерии — страница 5

  • Просмотров 508
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 23
    Кб

ДНК, — плазмиды и вставки, — и выдерживают их при оптимальной температуре «гибридизации». Чужеродная ДНК «встраивается» в ДНК плазмиды, хотя и может превышать ее по длине, т. е. достигать размера в несколько тысяч пар оснований. Окончательное слияние, «приживание» новой ДНК, разумеется, обеспечивают ДНК-лигазы. Я употребил термин «гибридизация». Что он обозначает в данном случае? Условимся называть так образование двухнитевой

структуры в результате контакта двух комплементарных однонитевых последовательностей нуклеотидов, типа ДНК-ДНК или ДНК-РНК. Термин «комплементарные» нам уже знаком. Последовательности могут быть одинаковой длины, тогда образуется сплошь двухнитевой «гибрид». А могут быть и существенно различными по длине. В этом случае образуется «участок гибридизации», соответствующий длине более короткого из двух партнеров. Минимальная

длина участка гибридизации, при которой он достаточно устойчив, — это 8-10 пар нуклеотидов. Впрочем, для устойчивой гибридизации комплементарных липких концов двух молекул ДНК эту цифру можно уменьшить вдвое, так как двунитевые структуры самих ДНК будут поддерживать новообразованный короткий участок гибридизации. Может возникнуть вопрос: а почему сама разрезанная плаз-мида не восстанавливает кольцевую структуру путем

гибридизации своих собственных липких концов? Ну, во-первых для сравнительно короткой ДНК плазмиды не так-то просто, распрямившись, самопроизвольно снова свернуться в кольцо. Во-вторых, встраиваемый фрагмент ДНК берется в большом избытке с тем, чтобы процесс встраивания в плазмиду имел конкурентное преимущество по отношению к процессу восстановления плазмиды. С этой же целью 5'-фосфатные группы из места разреза плазмиды

убирают действием еще одного фермента — «щелочной фосфата-зы». Поначалу достаточно, чтобы соединилась одна пара липких концов, принадлежащих плазмиде и встраиваемой ДНК. Со временем, непременно, благодаря тепловым движениям соединится и вторая пара. И все-таки поставленный вопрос не напрасен. Полностью избежать «реставрации» пустых плазмид, действительно, не удается. К счастью найден способ различать среди колоний бактерий,

выросших на среде с антибиотиком, те, которые приютили « пустую « плазмиду от тех, что получили плазмиды со встроенным фрагментом чужой ДНК. Способ этот очень красив. Идея его такова. Некоторая модификация самой плазмиды позволяет ей в «сотрудничестве» с основным геномом бактерии E.coli в присутствии некоего хромогенного субстрата (похожего на лактозу) синтезировать продукт голубого цвета. В результате на чашке с агаром