Метилотрофные бактерии - источники изотопно-меченных Н-2 и С-13 аминокислот — страница 6

  • Просмотров 734
  • Скачиваний 16
  • Размер файла 185
    Кб

биомассы, в то время как на средах с 98 об.% 2Н2О микробный рост подавлялся. Так, на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н, выход микробной биомассы был снижен в 3,3 раза по-сравнению с контролем. Важно, что выход микробной биомассы, время клеточной генерации и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости при росте адаптированного к 2H2O штамма B. methylicum на среде, содержащей 98 об.% 2Н2О и 2 об.% С2Н3О2Н изменяются незначительно

(табл. 2, опыт 10’). Таблица 2. Влияние изотопного состава среды на рост штамма B. methylicum и уровень накопления L-фенилаланина в культуральной жидкости. Номер Компоненты среды, об% Величина Выход Время ген. Уровень опыта лаг-фазы биомассы часы секреции Н2О 2Н2О СН3ОН С2Н3О2Н часы % L-Phe, % 1 98 0 2 0 24,0 100 2,2 100 2 98 0 0 2 30,3 92,3 2,4 99,1 3 73,5 24,5 2 0 32,1 90,6 2,4 96,3 4 73,5 24,5 0 2 34,7 85,9 2,6 97,1 5 49,0 49,0 2 0 40,5 70,1 3,0 98,0 6 49,0 49,0 0 2 44,2 60,5 3,2 98,8 7 24,5 73,5 2 0 45,8 56,4 3,5 90,4 8 24,5 73,5 0 2 49,0 47,2 3,8 87,6 9 0 98,0 2 0 60,5

32,9 4,4 79,5 10 0 98,0 0 2 64,4 30,1 4,9 71,5 10’ 0 98,0 0 2 39,9 87,0 2,9 95,0 *Данные (1-10) приведены для B. methylicum, не адаптированного к средам с высоким содержанием дейтерия. Данные 10’ приведены для адаптированого B. methylicum. За счёт использования данного штамма B. methylicum удалось получить десятки миллиграмм высокомеченного дейтерием фенилаланина из 20 г клеточной биомассы. Изучение уровней включения изотопов 2Н- и 13С в секретируемые аминокислоты метилотрофных

бактерий. Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной работе уровни включения изотопов 2Н-и 13С в мультикомпонентные смеси аминокислот в составе культуральной жидкости и белковых гидролизатов определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров дансил-аминокислот или в виде Z-производных аминокислот

после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ. Производные аминокислот получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости и гидролизатов суммарных белков биомассы карбобензоксихлоридом (ZCl) или дансилхлоридом (DnsCl) и диазометаном (CH2N2). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1 (схема 1). Для

лизина, гистидина, тирозина, серина, треонина и цистеина наряду с монопроизводными было характерно образование ди-Z-(Dns)-производных: ди-Z,(Dns)-лизина, ди-Z,(Dns)-гистидина, О,N-ди-Z,(Dns)-тирозина, O,N-ди-Z,(Dns)-серина, O,N-ди-Z,(Dns)-треонина и N,S-ди-Z,(Dns)-цистеина (на схеме 1 эти произодные не показаны). Кроме этого, из аргинина синтезировался три-Z,(Dns)-аргинин. Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за