Как гены человека наносят на карту. — страница 6

  • Просмотров 350
  • Скачиваний 13
  • Размер файла 70
    Кб

вставили каждый ее отрезок в молекулу вектора (бактериальной, дрожжевой или другой кольцевой ДНК), разрезанную в одной точке той же рестриктазой: получилась рекомбинантная кольцевая ДНК с "чужой" вставкой. Такую смешанную ДНК "вселяют" в ядро клетки-хозяина (обычно бактерии), и та принимается делиться в культуре, благодаря рекомбинантная ДНК – и.о. ее генома – размножается практически до любого количества копий.

Результат – набор клонов разных фрагментов картируемой ДНК, или, как его обычно называют, библиотека клонов. ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) – лабораторный синтез фрагментов ДНК без клетки-хозяина. В пробирку к фрагменту, который надо размножить, "подсаживают": а) фермент ДНК-полимеразу, который осуществляет воспроизведение ДНК в живых клетках; б) стройматериал, т.е. отдельные нуклеотиды; в) прамеры – короткие цепочки

нуклеотидов, соответствующие концам размножаемого фрагмента. Тут, как видите, слабое место метода: про упомянутый участок надо кое-что знать заранее – а именно структуру праймеров… Затем пробирку нагревают – фрагмент от жары "расклеивается", разделяясь на две цепи; пробирку охлаждают – праймеры присоединяются к концам фрагмента и полимераза начинает свое дело. Чередуя нагревания и охлаждения, можно за полтора часа

довести количество копий нужного участка ДНК до нескольких миллионов – в чем и состоит главное преимущество ПЦР перед клонированием. Но у нее есть два недостатка. Один уже упомянут – нужно знать праймеры "в лицо", иначе реакцию не удастся запустить. Второй – техническая невозможность копировать фрагменты длиннее 5-6 п.н. После того как все фрагменты ДНК получены в достаточном количестве копий, их упорядочивают, для чего

сперва разделяют электрофорезом, а затем химически связывают (гибридизуют) с меченым зондом, чтобы каждый фрагмент встал на свое место и, так сказать, просигналил о себе: вот он я! Крупномасштабные физические карты генома бывают двух типов. Первый – МАКРОРЕСТРИКЦИОННЫЕ (по принципу "сверху вниз"): ДНК режут редкощепящей рестриктазой на крупные куски, упорядочивают их, потом делят на более мелкие, которые тоже упорядочивают.

Такая карта охватывает довольно большие участки генома – до 10 Мб – и не содержит пробелов. Но ее разрешение сравнительно невелико – от 1 Мб до 100 кб. Гораздо выше точность у КАРТ КОНТИГ. Их строят по обратному принципу – "снизу вверх". Хромосому шинкуют на очень короткие фрагменты, размножают их и упорядочивают. Набор упорядоченных коротких фрагментов, покрывающих определенный участок хромосомы, - это и есть контига. А где