Изучение биосинтеза аминокислот штаммом Вrevibacterium methylicum при росте на средах, содержащих тяжелую воду и дейтеро-метанол — страница 5

  • Просмотров 433
  • Скачиваний 17
  • Размер файла 875
    Кб

ди-дансильных производных, а для тирозина также происходит дополнительное дансилирование по гидроксильной -ОН-группе. При этерификации аминокислот диазометаном не исключено дополнительное N-метилирование по а-NH2-группе аминокислот, что приводит к появлению в масс-спектре метиловых эфиров дансил-аминокислот пиков, соответствующих соединениям с молекулярной массой на 14 массовых единиц больше исходных [14]. В качестве примера

на рис. 2,б приведен масс-спектр секретируемого фенилаланина и сопутствующих аминокислот в составе дериватизированной культуральной жидкости в условиях эксперимента 5 (см. табл.1, опыт 5), где концентрация D2О в среде достигает 49 об.% (спектр приведен относительно контрольных условий (а), где использовали обычную воду и метанол). Из рис.2,б видно, что в этих условиях величина пика молекулярного иона производного фенилаланина (М+. с m/z

414,2) увеличивается по сравнению с контрольными условиями (М+. с m/z 412,0) на 2,2 единицы, что составляет 27,5 % от общего количества атомов водорода в молекуле. Пик с m/z 400, зафиксированный в масс-спектре культуральной жидкости (рис.2,б) вероятнее всего соответствует продукту отщепления метильной группы -СН3 от дейтерированного производного фенилаланина. Масс-спектр культуральной жидкости, полученной на среде, содержащей 73,5 об.% D2О и 2 об. %

СН3ОН после обработки дансилхлоридом и диазометаном представлен на рис. 3,а. Присутствие в масс-спектре этого образца пика молекулярного иона метилового эфира дансил-фенилаланина с М+. с m/z 416,1 (вместо 412 в контроле) указывает на увеличение массы фенилаланина на 4,1 единицу, т.е., 51,2 % атомов в молекуле фенилаланина замещены на дейтерий (рис. 3,а). Необходимо подчеркнуть, что вышеобозначенные атомы дейтерия включаются в молекулу

фенилаланина за счет процесса биосинтеза de novo, т. е. по углеродному скелету молекулы, так как маловероятно, что они заместились в в ходе выделения аминокислоты из культуральной жидкости или при химической модификации фенилаланина. Что касается протонов (дейтеронов) при гетероатомах в NH2-, NH-, и -COOH группах аминокислот, то они за счёт лёгкости диссоциации легко обмениваются на дейтерий даже при растворении аминокислот в D2O. Так как

все этапы, связанные с обработкой культуральной жидкости, содержащей дейтерий и её химической модификации проводились с использованием немеченных компонентов, растворителей и в т.ч. водных растворов, то эти протоны(дейтероны) из-за лёгкости диссоциации труднее всего поддаются точному подсчёту и контролю. Это могло служить причиной небольшого расхождения результатов при подсчёте степеней дейтерированности аминокислот. Во