Исследование процесса физиологической адаптации бактерий к тяжёлой воде — страница 4

  • Просмотров 517
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 130
    Кб

растворе 2HСl (в 2H2O) (08 ати, 30 мин), нейтрализовали 0.1 н. КОН (рН 7.0) и использовали далее в качестве источника ростовых факторов для адаптации и культивирования бацилл и галофильных бактерий. В настоящей работе использовали следующие питательные среды (количества компонентов приведены в г/л): 1. Минимальная среда М9, на основе различных концентраций 2H2O (см. табл. 1 и табл. 2) и добавками 0.5-2% метанола (в зависимости от физиологической

потребности бактерий) или [U-2H]метанола: KH2PO4 3; Na2HPO4 6; NaCl 0.5; NH4Cl 1. Среду использовали для культивирования метилотрофных бактерий. 2. Гидролизная среда 1 (ГС1) для культивирования бацилл (на основе 100% 2H2О): глюкоза 120; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 25; NH4NO3 30; MgSO4 x 7H2O 20; мел 20. 3. Гидролизная среда 2 (ГС2) для культивирования галофильных бактерий (на основе 100% 2H2О): NaCl 250; MgSO4 x 7H2O 20; KCl 2; CaCl2 x 6H2O 0.065; цитрат натрия 0.5; (2Н)меченая биомасса B. methylicum 20.

Культивирование метилотрофных бактерий и бацилл проводили при 370 С в колбах Эрленмейера вместимостью 250 мл с наполнением средой до 50 мл в условиях интенсивной аэрации по методикам [14] и [15], используя в качестве источников дейтерия 2H2O и [U-2H]метанол. В случае с галофильными бактериями их культивирование проводили на 2H2O-среде при освещении лампами дневного света ЛБ-40. После 6-7 суток культивирования клетки отделяли

центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин). В культуральных жидкостях анализировали секретируемые аминокислоты и нуклеозиды. Для выделения фракции суммарных белков биомассы клетки дважды промывали дистиллированной водой с последующим центрифугированием (10000 об/мин, 20 мин), экспонировали ультразвуком при 22 кГц (3 x 15 мин) и центрифугировали. Липиды и пигменты экстрагировали смесью органических растворителей

хлороформ-метанол-ацетон (2:1:1) по методу Блайя и Дайера [23]. Полученный осадок высушивали до постоянного веса (10-12 мг) и использовали его в качестве фракции суммарных белков биомассы. Суммарные белки биомассы гидролизовали в запаянных стеклянных ампулах в 50-ти кратном избытке 6 н. 2HCl (в 2H2O). Ампулы выдерживали при 1100 в течение 24 ч. После этого реакционную массу суспендировали в горячей дистиллированной воде, фильтровали. Гидролизат

упаривали в роторном испарителе при 400 С. Остатки дейтеросоляной кислоты удаляли путем выдерживания в эксикаторе над твердым NaOH. Для проведения гидролиза внутриклеточных полисахаридов 50 мг сухой делипидизованной биомассы помещали в круглодонную колбу вмесимостью 250 мл, добавляли 50 мл дистиллированной воды и 1.6 мл 25% 2H2SO4 и кипятили с обратным водяным холодильником в течении 90 мин. По охлаждении реакционную смесь