Искусственный синтез олигонуклеотидов — страница 4

  • Просмотров 675
  • Скачиваний 18
  • Размер файла 47
    Кб

для этого оптимальные условия (буфер, концентрация соли, умеренно повышенная температура). Мы получим структуру, с которой начнется 2-й этап. 2 этап. Добавим в раствор нам еще не встречавшийся фермент — «обратную транскриптазу». В присутствии 4-х дезоксирибонуклеотидов этот фермент способен вести комплементарный синтез ДНК по матрице РНК в нормальном направлении от 3' к 5'-концу матрицы. Он тоже нуждается в праймере, каковым для

него послужит уже сидящий на 3'-конце иРНК олиго дТ 3 этап. Обработаем полученный РНК-ДНК гибрид упомянутой ранее рибонуклеазой Н. Она как раз разрушает РНК, находящуюся в двунитевом гибридном комплексе с ДНК (см. там же). Однако поставим этот фермент в такие условия, чтобы наша иРНК была разрушена не до конца — остались небольшие ее участки. 4 этап. От этих участков, как от праймеров, начнет работать вносимая на этом этапе

ДНК-полимераза I. Она, как нам известно, не только ведет матричный синтез ДНК, но и обладает S'-S* экзо-нуклеазной активностью. Благодаря этому она разрушает остатки иРНК и образует из синтезированных ею фрагментов, не без помощи все той же ДНК-лигазы, полноценную нить ДНК. Полученную таким образом двухнитевую молекулу принято именовать «кДНК», имея в виду, что она является комплементарно выстроенным отображением исходной иРНК.

Эта ДНК соответствует значащей последовательности нашего гена, поскольку все интроны (повторю это еще раз) были «вырезаны» уже при выходе исходной иРНК из ядра в цитоплазму. РНК-полимераза бактерии, которой придется транскрибировать плазмидную ДНК, на участке этой встроенной кДНК произведет полноценную иРНК для синтеза интересующего нас белка. 2.2 ЧИП-методика Более простая часть задачи получения гена, когда в нашем

распоряжении имеется нужная индивидуальная иРНК. Но как ее получить, если мы располагаем только некоторым количеством клеток животного происхождения, в которых синтезировался интересующий нас белок, и, следовательно, имеется соответствующая ему иРНК? Очевидно начать надо с того, что отделить суммарную фракцию всех иРНК этих клеток от всех прочих РНК. Для этого достаточно закрепить на неподвижной твердой основе в достаточном

количестве молекулы все того же олиго дТ и пропустить мимо них раствор всех выделенных РНК клеток. Это делается методом колоночной «аффинной» хроматографии, с которым мы в свое время будем знакомиться подробно. Но и так ясно, что нетрудно создать условия, при которых закрепленные неподвижно олиго дТ «выхватят» из протекающего мимо раствора суммарных РНК все молекулы иРНК путем гибридизации с их поли А «хвостами». Все прочие