Иммунологические методы, основанные на взаимодействии антиген–антитело — страница 7

  • Просмотров 2270
  • Скачиваний 19
  • Размер файла 26
    Кб

против холостой пробы (буфер + антисыворотка). С исследуемым образцом поступают так же, как со стандартными растворами. Определяют его экстинкцию и по восходящей части кривой устанавливают концентрацию антигена. Если приходится исследовать мутные или окрашенные растворы антигенов, следует предварительно измерить их собственную экстинкцию, чтобы учесть ее при оценке результатов. Затем с учетом разведения исходного материала

вычисляют концентрацию исследуемого антигена. Полную уверенность в том, что полученная величина экстинкции соответствует области избытка антител, дает исследование, проведенное с несколькими разведениями антигена. Условия инкубации должны быть строго постоянными. Для фотометрии следует выбирать длину волны, лежащую за пределами областей поглощения гемоглобина (400 – 420 нм). Необходимо также учитывать спектр собственного

поглощения реагентов и их смеси до образования иммунных агрегатов. 4.3. Оценка метода Преимущества нефелометрии – относительная простота и быстрота процедуры, а также возможность ее автоматизации. Однако этот метод предъявляет особые требования к качеству антисыворотки. Она должна содержать достаточно антител, чтобы в разведении антител не менее 1:5 обеспечить величину максимальной экстинкции выше 0,2. Антисыворотка должна

быть прозрачной. 5. Иммунодот и иммуноспот Твердофазный иммуноферментный анализ является наиболее популярным методом в диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных. Однако этот метод имеет ряд недостатков. В модифицированном варианте для адсорбции различных антигенов используют нитроцеллюлозные фильтры. Такую модификацию называют dot-ELISA (точечный твердофазный

иммуноферментный анализ). В dot-ELISA минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку в виде серии точек. Преципитирующие хромогенные субстраты на белом нитроцеллюлозном фильтре образуют цветные пятна. Фильтры с результатами анализа могут храниться в темноте в течение многих лет без потери окраски. В dot-ELISA можно применять различные препараты антигенов. На нитроцеллюлозных мембранах можно

сорбировать как жизнеспособные или фиксированные формалином простейшие, так и супернатанты, полученные после разрушения клеток. Пятно антигена наносят в объеме от 0,1 до 3 мкл. В случае препаратов солюбизированных антигенов предпочтительнее использовать мембраны с малым диаметром пор. При применении целых клеток величина пор не играет большой роли. Все стадии инкубации и промывки выполняют при комнатной температуре. Сначала