Группа пневмовирусов — страница 10

  • Просмотров 1611
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 354
    Кб

заражения проводят импульсное мечение. Для этого культуральную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего 30 мкКи - метионина и 25 мкКи - цистеина, и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч. 2. Радиоактивный раствор сливают и монослой промывают охлажденным PBS. 3. Клетки снимают со стекла с помощью стерильной резиновой палочки и осаждают центрифугированием. 4. Клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера, инкубируют суспензию 30 мин в

ледяной бане, затем интенсивно перемешивают. 5. Ядра и клеточный дебрис удаляют центрифугированием 5 мин при 10 000 g. 6. Лизат осветляют инкубацией с 50 мкл 10% -ной суспензии фиксированных формалином стафилококков или с 50 мкл суспензии покрытых белком-А гранул 30 мин при 0°С. 7. Стафилококки удаляют центрифугированием. К 50 мкл лизата добавляют 10 мкл гипериммунной сыворотки, перемешивают и инкубируют 3 ч во льду. 8. Добавляют 100 мкл

суспензии стафилококков, перемешивают и инкубируют смесь 30 мин при комнатной температуре. 9. Иммунные комплексы осаждают центрифугированием 20 с при 10 000 g. 10. Осадок 3 раза промывают раствором, содержащим 500 мМ LiCl, 100 мМ трис-HCl, рН 8,5. 11. Осадок после промывки ресуспендируют в 50 мкл смеыг для диссоциации, кипятят 2 мин и либо немедленно наносят на гель для электрофореза, либо хранят при - 20 °С. 3.2 Метод выявления дефектных

интерферирующих частиц Дефектные интерферирующие частицы и стандартные вирионы РСВ не удается разделить физическими методами, на проявление устойчивой к ультрафиолетовому облучению и чувствительной к нейтрализующим антителам интерферирующей активности при пассировании вируса с высокой множественностью инфекции свидетельствует о накоплении ДИЧ. Разра-Зотзн колориметрический метод количественного определения ДИЧ в

препаратах РСВ. Он основан на измерении интенсивности окрашивания, обусловленного поглощением нейтрального красного клетками, которые выживают при заражении стандартным вирусом в результате защиты ДИЧ. Приводятся данные о том, что колориметрический метод чувствительнее, чем метод, основанный на определении снижения выхода вируса. Колориметрический анализ проводят следующим образом. 1. Монослойные культуры клеток Нер-2,

выращенные в лунках планшета диаметром 16 мм, инкубируют с содержащим ДИЧ материалом 2 ч при 37 °С. 2. Содержащий ДИЧ иннокулят удаляют и заражают клетки стандартным вирусом, полученным в результате пассирования с низкой множественностью, и продолжают адсорбцию 2 ч при 37 °С. 3. В каждую лунку вносят по 1 мл культуральной среды и инкубируют клетки 72 ч при 37 °С. 4. Среду удаляют и вносят в каждую лунку по 0,5 мл нейтрального красного в