Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе — страница 23

  • Просмотров 3064
  • Скачиваний 27
  • Размер файла 3070
    Кб

повышении концентрации ионов меди (II), вследствие их чрезмерного поступления извне, происходит образование свободных радикалов. Ход эксперимента выглядел следующим образом. Вначале приготовили контрольную пробу, в которой находился раствор альбумина с пероксидом водорода. Затем готовили опытный раствор альбумина, куда добавили вначале пероксид водорода, а затем, через два часа – сульфат меди (II) выше указанных концентраций

соответственно. Далее опытную и контрольную пробу нанесли на колонки, содержащие гель TSK - HW55. Собрали элюированные пробы и получили профиль элюции белков. Затем проводили флуоресцентную спектроскопию белковых фракций, полученных элюированием сывороточного альбумина на геле TSK - HW55. Длина волны возбуждения ультрафиолетом (УФ) равнялась 290 нм, длина волны регистрации флуоресценции составляла 350 нм. При возбуждении фракции УФ

излучением с длиной волны 290 нм, наблюдали появление, кроме полосы флуоресценции триптофана, дополнительной полосы флуоресценции, обладающей длинноволновым сдвигом, с длиной волны 360 нм. Предположили, что данная полоса свечения возникла при окислении свободными радикалами остатка гистидина. Для проверки данной гипотезы провели химическую реакцию взаимодействия гистидина со смесью сульфата меди и пероксида водорода. Затем

производили измерение флуоресценции продуктов окисления гистидина. Максимум интенсивности флуоресценции соответствовал длине волны 360 нм, что совпадало с флуоресцентной характеристикой дополнительной полосы свечения белковой фракции. Далее изменили длину волны возбуждения на 360 нм и регистрировали появление нового спектра флуоресцеции, обладающего длинноволновым сдвигом. 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1 Исследование влияния

сверхвысоких концентраций мочевины на конформацию альбумина В результате проведения эксперимента были получены результаты, отражённые на графиках зависимости интенсивности собственной и зондовой флуоресценции от концентрации мочевины и длины волны возбуждающего и эмиссионного света. Для интерпретации полученных результатов нужно упомянуть, что в нативном белке в водных растворах собственная флуоресценция,

обусловленная триптофаном наблюдается при значении длины волны экстинции на 280 -290 нм и при значении длины волны эмиссии на 350 нм. Экстинция зонда АНС = 320 нм, а эмиссия – 450 нм. Из полученных результатов следует, что сверхвысокие концентрации мочевины уменьшают интенсивность как собственной так и зондовой флуоресценции. Это можно увидеть на рисунках 5 – 10. Однако падение интенсивности собственной флуоресценции белка носит