Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе — страница 22

  • Просмотров 3052
  • Скачиваний 27
  • Размер файла 3070
    Кб

Хроматографию проводили на TSK - HW55 геле. Эксцинцию для собственной флуоресценции устанавливали на приборе при длине волны 280, 290 нм, эмиссию при длине волны 350 нм. Эксцинцию зондовой флуоресценции устанавливали при длинах волн 280, 290 и 320 нм, эмиссию – при длине волны 450 нм. Для изучения влияния различных концентраций мочевины на бычий сывороточный альбумин (БСА) использовали концентрацию белка, равную 0,66 г/л, или 10-5 моль/л. Раствор

БСА с концентрацией 10-5 М готовили в трёх различных буферах: фосфатный с рН 7,43, трис-буфер с рН 9,08, ацетатный с рН 4,54. Концентрация БСА 0,66 г/л является оптимальной, т.е. флуоресценция белка связана прямопропорциональной зависимостью с концентрацией. Для нахождения данной концентрации строили калибровочный график зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации белка. На графике нашли отрезок, характеризующийся прямой

пропорциональной зависимостью и, поделив его пополам, получили значение оптимальной концентрации альбумина. Концентрации мочевины, которые брались для эксперемента находились в интервале от 2М до 10 М. По сравнению с соотношением содержания мочевины и сывороточного альбумина в организме (10 : 1), для эксперимента бралось соотношение мочевины и альбумина 1 : 10000 – 100000 соответственно. Т.о концентрации мочевины были взяты

сверхвысокими. Помимо собственной флуоресценции белка исследовали зондовую флуоресценцию. В качестве зонда использовали N-фенил-1-амино-8-сульфонафталин (АНС). Количество зонда, необходимое для реакции с альбумином, рассчитывали, исходя из того, что количество центров на альбумине для АНС равно 5 – 6. Поэтому концентрация зонда для эксперимента взяли равной 6 ∙ 10-5 моль/л. Данные зондовой флуоресценции наряду с данными о

собственной флуоресценции могут дать дополнительную информацию о конформационных изменениях белка, т.к. зондовая флуоресценция более чувствительна к изменениям структуры белка, чем собственная флуоресценция. Для изучения влияния свободных радикалов на бычий сывороточный альбумин использовали концентрацию альбумина 10-5 М. Раствор альбумина готовили в фосфатном буфере (Na2HPO4 – KH2PO4 (1/15M)) с pH = 7,44, близкой к физиологическому

значению рН крови. Свободные радикалы образовывались в растворе альбумина, по реакции Вейсса – Габера, путём добавления смеси пероксида водорода с концентрацией 3 · 10-5 и сульфата меди (II) – 12 · 10-4 моль/л. В организме человека пероксид водорода и ионы меди (II) содержатся в количествах, примерно равных 30 мкмоль/л и 12 мкмоль/л соответственно. При таком соотношении в организме свободные радикалы практически не образуются, но при