Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе — страница 19

  • Просмотров 3068
  • Скачиваний 27
  • Размер файла 3070
    Кб

Активное использование флуоресцентных зондов для изучения структуры белков началось с 1965 года. Наиболее подробно исследовано взаимодействие с альбумином отрицательно заряженного зонда АНС. Имеется около 5 центров связывания АНС на молекуле альбумина. При этом 2-3 из них имеют более высокую константу связывания. Попадая в эти центры, молекула АНС оказывается в жестком окружении, а ее гидрофобная группа полностью скрыта от

молекул воды. Примерно 90% флуоресценции АНС происходит именно из этих центров. Остальные 2-3 центра связывают АНС слабее, и в них зонд частично доступен воде. При переходе от рН 7 к рН 4 (N-F переход) константа связывания АНС сильными центрами снижается, однако число таких центров возрастает, за счет чего интенсивность флуоресценции АНС тоже возрастает. При этом сильные центры по-прежнему хорошо скрывают молекулу АНС от воды.

Благодаря тому, что флуоресцируют практически только те молекулы АНС, которые связаны с альбумином, легко измерить параметры связывания зонда с белком. Незаряженный зонд ДМХ (4-диметиламинохалкон) связывается с 2-3 центрами альбумина. Подобно АНС, он попадает в жесткое окружение, что видно по появлению кругового дихроизма, и скрыт от молекул воды, которые теперь уже не тушат флуоресценцию ДМХ. Молекула ДМХ контактирует в этих

центрах с двумя остатками тирозина, расположенными вблизи поверхности белковой глобулы. Такой контакт с фенольными группами тирозина приводит к частичному тушению флоуресценции ДМХ. При переходе от рН 7 к рН 9 (переход N-B) эти два остатка тирозина ионизируются: один становится отрицательно заряженным к рН 9, второй – к рН=10,5. Остальные 16 остатков тирозина ионизируются только при рН > 10,5. В результате ионизации первых двух

остатков тирозина они выходят на поверхность белка, оставив ДМХ в глубине центра связывания, их тушащее влияние уменьшается, и интенсивность флуоресценции ДМХ возрастает. В свою очередь, ДМХ перестает влиять на круговой дихроизм этих остатков тирозина. Дальнейшее увеличение рН приводит к разрыхлению белковой молекулы, что видно по снижению флуоресценции ДМХ, молекула которого становится теперь доступной тушащему действию

молекул воды. При снижении рН от 7 к 3 (переход N-F) центры связывания ДМХ разрыхляются, в них проникает вода и тушит флуоресценцию ДМХ. Отрицательно заряженный зонд К-35 был предложен специально для исследования состояния альбумина в сыворотке крови при патологии. К-35 имеет величину константы связывания с альбумином примерно такую же, как АНС, около 1,8 ∙ 10 5 М-1, и занимает два типа центров. Примерно 23% связанных молекул К-35 находится в