Флуоресцентный метод исследования конформационных изменений альбумина в растворе — страница 18

  • Просмотров 2980
  • Скачиваний 27
  • Размер файла 3070
    Кб

входящими в состав полипепидной цепи макромолекул (собственная люминесценция), простетическими группами (восстановленные пиридиннуклеотиды и флавины), связанными с белковой частью сложных ферментов, химически присоединённой меткой (красителем), а также зондом (зондовая люминесценция). Собственная люминесценция белка обусловлена в целом аминокислотами, имеющими ароматический радикал, а значит это – триптофан, тирозин,

гистидин, фенилаланин. Поглощение этих аминокислот в области 250 – 300 нм довольно значительно. Из других аминокислот только цистин имеет в этой области поглощение, сравнимое с фенилаланином ε240 = 300, ε290 = 50; пептидная связь поглощает в области более 220 нм. Включение ароматических аминокислот в состав белков сопровождается небольшим сдвигом в «красную» сторону, при этом слегка увеличивается поглощательная способность

хромофоров[45]. 1.6 Применение зондовой флуоресценции для изучения структуры молекулы альбумина Способность красителей связываться с белками и реагировать на состояние белковой молекулы, известна давно. Вначале о структуре и поведении альбумина судили по изменению поглощения света красителем. И.Клотц использовал метиловый оранжевый и другие красители – органические кислоты с отрицательным зарядом [46]. По мере появления

приборов, регистрирующих слабые потоки люминесцентного света, стали использоваться и флуоресцирующие красители. Флуоресценция обычно гораздо более чувствительна к изменениям окружения молекулы красителя, чем поглощение света, и имеет ряд других особенностей, благодаря которым флуоресцентные красители приобрели большое распространение в исследовании белков. Краситель может быть связан с белком ковалентно (необратимо)

благодаря химической связи или нековалентно (обратимо) благодаря слабым гидрофобным и электростатическим взаимодействиям. Первую группу обычно называют метками, вторую - зондами. В 1952 году Г.Вебер впервые применил флуоресцентную метку, а Д.Лоуренс - флуоресцентный зонд для изучения структуры альбумина. Выяснилось, что флуоресценция зондов очень чувствительна к перестройкам в глобуле альбумина, чего нельзя сказать, используя

флуоресцентные метки. При связывании зонда АНС (1-амино-N-фенил-8-сульфонафталин) с альбумином интенсивность флуоресценции зонда возрастает в сотни раз. Это свойство АНС почти сразу же попытались использовать для клинического измерения концентрации альбумина в сыворотке. Однако оказалось, что при патологиях, особенно при гипербилирубинемии, флуоресценция АНС в альбумине снижается, что мешает количественному его определению.