Физиологическая адаптация нового RuMP штамма факультативных метилотрофных бактерий Brevibacterium methylicum к тяжелой воде — страница 4

  • Просмотров 389
  • Скачиваний 12
  • Размер файла 76
    Кб

дейтерия в молекулы аминокислот определяли методом масс-спектрометрии EI MS в виде метиловых эфиров N-Dns-производных аминокислот на приборе MB-80A (Hitachi, Япония) при ионизирующем напряжении 70эВ, используя прямую дериватизацию лиофилизированных культуральных жидкостей дансилхлоридом и диазометаном [14]. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Выращивание штамма на 2Н2О-содержащих средах. Для выращивания штамма был выбран

ступенчато-увеличивающийся градиент концентрации 2H2О в ростовых средах в присутствии 2 об.% [U -2H] MetOH, так как предпологалось, что постепенное привыкание клетки к 2Н2О будет оказывать благоприятный эффект на параметры роста и общее самочувствие культуры (таблица). Для компенсации ауксотрофности по лейцину эту аминокислоту добавляли в ростовую среду в протонированном виде в концентрации 10 мг/л. Сначала исходный штамм выращивали

на 2Н2О-содержащих средах без его предварительной адаптации к 2Н2О, для того чтобы определить его ростовые и биосинтетические параметры на этих средах. При росте исходного штамма на контрольной среде с обычной водой продолжительность лаг-фазы и время клеточной генерации составили 20 и 2.2 ч соответственно (таблица, опыт 1). В промежуточных экспериментах эти параметры изменялись пропорционально концентрации 2Н2О. В частности,

продолжительность лаг-фазы и время клеточной генерации увеличивались, а рост и уровень накопления фенилаланина уменьшались, причем самые низкие значения были зафиксированы на максимально дейтерированной среде с 98 об.% 2Н2О. Так, в эксперименте (5), таблица, выход микробной биомассы был снижен в 3.3, а уровень накопления фенилаланина в ростовой среде в 2.7 раз по сравнению с контролем, поэтому было необходимо проводить адаптацию

штамма к 2Н2О. Таблица. Изотопный состав ростовых сред и параметры бактериального роста исходного штамма Компоненты среды, об.% H2O 2H2O MetOH [U -2H] MetOH лаг-фаза (ч) Выход биомассы((%) Время генерации (ч) Максимальный уровень накопления фенилаланина в ростовой среде (%) (1) 98 0 2 0 20 100.0 2.2 100.0 (2) 73.5 24.5 0 2 34 85.9 2.6 97.1 (3) 49.0 49.0 0 2 44 60.5 3.2 98.8 (4) 24.5 73.5 0 2 49 47.2 3.8 87.6 (5) 0 98.0 0 2 60 30.1 4.9 37.0 Клеточная адаптация к 2Н2О. Специальный подход по адаптации заключался в серии из

четырех адаптационных пассажей исходной культуры на твёрдых агаризованных средах с 2 об.% [U-2H] MetOH с 0, 24.5, 49, 73.5 и 98 об.% 2Н2О. При этом отбирали отдельные колонии, выросшие на средах с низкими концентрациями 2Н2О. Затем их последовательно пересевали на среды с большей концентрацией 2Н2О, включая среду с 98 об.% 2H2О, проводя их параллельные контрольные рассевы на протонированной среде (степень выживаемости бактерий составила не более 40%).