Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии — страница 6

  • Просмотров 684
  • Скачиваний 11
  • Размер файла 23
    Кб

кДа. Изобретение включает также рекомбинантные плазмиды и трансформированные клетки-хозяева, способные продуцировать фермент. Фрагмент выделенной ДНК с нуклеотидной последовательностью, приведенной в описании, кодирует термостабильную ДНК-полимеразу. Фрагмент ДНК получают из Carboxydothermus hydrogenoformans. Культивируют природный штамм Carboxydothermus hydrogenoformans или Е. coli BL21 (DE3) pUBS520pAR4 DSM 11179. Клетки штамма суспендируют в буфере, разрушают клетки.

Очищают выделенную ДНК-полимеразу методом хроматографии. При амплификации, введении метки и проведении обратной транскрипции используют термостабильную ДНК-полимеразу. Изобретение обеспечивает получение ДНК-полимеразы, активной при более высоких температурах, обладающей 3'-5'-полимеразной активностью и обратнотранскриптазной активностью в присутствии ионов магния и отсутствии ионов марганца. 6 с. и 2 з.п. ф-лы, 12 ил. Ферменты,

используемые в молекулярном клонировании Рестрикционные эндонуклеазы. Основные принципы организации систем рестрикции–модификации у бактерий. Роль систем рестрикции – модификации в регуляции переноса генетической информации между бактериями. Классификация и номенклатура рестриктаз. Изошизомеры. Крупно- и мелкощепящие рестриктазы. Фрагменты с выступающими 3’- , 5’- и тупыми концами. Встречаемость тетра- и

гексануклеотидов в ДНК. Лигирование фрагментов ДНК с липкими концами, образуемыми разными рестриктазами. Гибридные сайты. Единица активности рестриктазы. Определение количества фермента, необходимого для гидролиза ДНК определенного размера и с известным числом рестрикционных сайтов. Активность рестриктазы и свойства субстрата (длина и состав оснований фланкирующих последовательностей, расположение сайтов узнавания по

отношению друг к другу, структура ДНК). Специфичность рестриктаз. Снижение специфичности рестриктаз (“star-activity” - активность со звездочкой) и обуславливающие ее факторы. Определение размеров рестрикционных фрагментов с помощью электрофореза в агарозных и полиакриламидных гелях. Конформационные формы молекул ДНК. Маркеры размеров ДНК. Использование рестриктаз для конструирования рекомбинантных молекул in vitro. Сайты

рестрикции как генетические маркеры. Использование рестриктаз для физического картирования, анализа полиморфизма ДНК, штаммоспецифической характеристики вирусов и бактерий, идентификации плазмид. Использование сайтов рестрикции в качестве точек отсчета при секвенировании. ДНК- и РНК-лигазы фага Т4. ДНК-полимеразы из различных источников; их свойства и применение. ДНК-полимераза I из E.coli. Фрагмент Кленова ДНК-полимеразы I.