Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии — страница 5

  • Просмотров 681
  • Скачиваний 11
  • Размер файла 23
    Кб

патогенных и генетически модифицированных микроорганизмов в НИИЭМ им Н.Ф. Гамалея РАМН и при выявлении генетически модифицированных растений в Институте питания РАМН. ДНК-зависимые ДНК-полимеразы в генной инженерии Среди ДНК-зависимых ДНК-полимераз наибольшее применение в генной инженерии находят ДНК-полимераза I E. coli и ее большой фрагмент ( фрагмент Кленова ), Т4-ДНК-полимераза и термостабильные ДНК-полимеразы, особенно

ДНК-полимераза Thermus aquaticus ( Taq-полимераза ). Все эти ферменты в присутствии ионов Mg2+ из четырех дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и TTP) осуществляют синтез ДНК, комплементарной матричной ДНК, и для функционирования требуют наличия затравки на одноцепочечной матричной ДНК, т.е. олиго- или полидезоксирибонуклеотида со свободным 3'-ОН-концом, комплементарного матричной ДНК. ДНК-полимераза I E. coli: роль в синтезе ДНК и РНК

ДНК-полимераза I E. coli состоит из одной полипептидной цепи с молекулярной массой около 109 кДа и обладает тремя активностями: полимеризующей в направлении 5'->3', 5'->3'- экзонуклеазной и 3'->5'-экзонуклеазной. Большой фрагмент ДНК- полимеразы I E. coli ( фрагмент Кленова ) является частью полипептидной цепи ДНК-полимеразы I с молекулярной массой около 76 кДа, у которой отсутствует домен, соответствующий 5'->3'- экзонуклеазе. Как

ДНК-полимераза I, так и ее фрагмент используются для введения радиоактивно меченных дезоксирибонуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК путем ник- трансляции, т.е. перемещения одноцепочечного разрыва вдоль молекулы двухцепочечной ДНК, в котором 3'-ОН-конец используется в качестве затравки для ферментов. При этом ДНК-полимераза I прокладывает себе путь с помощью 5'->3'-экзонуклеазы, а фрагмент Кленова вытесняет цепь ДНК с 5'-конца.

Кроме того, фрагмент Кленова используют для синтеза второй цепи кДНК, секвенирования ДНК по методу Сенгера, заполнения 5'-выступающих "липких" концов ДНК с образованием "тупых" концов, введения концевой радиоактивной метки, а также для удаления 3'-выступающих концов рестрикционных фрагментов ДНК 3'->5'-экзонуклеазой этого фермента. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА, СПОСОБ ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ, ФРАГМЕНТ ВЫДЕЛЕННОЙ ДНК, СПОСОБ

АМПЛИФИКАЦИИ ДНК, СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ МЕТКИ В ДНК И СПОСОБ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ Патент Российской Федерации Суть изобретения: Изобретение относится к биотехнологии. ДНК-полимераза получена из термофильной эубактерии Carboxydothermus hydrogenoformans или Е. coli BL21 (DE3) pUBS520pAR4 DSM 11179. ДНК-полимераза проявляет зависимую от ионов магния обратнотранскриптазную активность и 3'-5'-экзонуклеазную активность, имеет кажущуюся молекулярную массу около 100-105