Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии

  • Просмотров 477
  • Скачиваний 11
  • Размер файла 23
    Кб

Ферменты для молекулярной биологии и генетической инженерии Тема: Биотехнология Дата: 24.5.06 К числу таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, ДНК-метилтрансферазы, эндонуклеазы рестрикции, ферменты репарации, ДНК-лигазы и т.д. Значительные достижения последних лет в области молекулярной биологии и генной инженерии во многом связаны с успешным использованием ферментов нуклеотидного обмена. К

числу таких ферментов относятся ДНК– и РНК-полимеразы, обратные транскриптазы, обеспечивающие воспроизведение молекул нуклеиновых кислот в клетке; ДНК-метилтрансферазы, ответственные за присоединение к ДНК метильных групп; эндонуклеазы рестрикции, способные узнавать специфические последовательности нуклеотидов в ДНК и разрезать ДНК в определенных местах; ферменты репарации, исправляющие ошибки (мутации) в ДНК, ДНК-лигазы,

сшивающие нити ДНК и т.д. Из большого арсенала методов анализа ДНК полимеразная цепная реакция (ПЦР), основанная на циклической репликации матрицы (реакцию проводят, циклически поднимая и понижая температуру, обычно в пределах от 40–55 до 95°C), наиболее широко применяется в генно-инженерной практике и клинической диагностике. В основе современной методологии ПЦР лежит использование термостабильной ДНК-полимеразы из

термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq-ДНК-полимеразы). Температурный оптимум ферментативной активности Taq-ДНК-полимеразы составляет 70–72°С, фермент сохраняет активность и при 95°C. Taq-ДНК-полимераза состоит из двух глобулярных пространственно разделенных доменов: полимеризационного, осуществляющего встраивание нуклеотидов в растущую цепь ДНК, и домена, обладающего 5’–3’-экзонуклеазной активностью. Благодаря

5’–3’-экзонуклеазной активности Taq-ДНК-полимераза расщепляет небольшие фрагменты ДНК, присоединенные к цепи ДНК, которая используется в качестве матрицы при полимеризации. Такое свойство фермента нашло применение в количественных методиках ПЦР для разрушения флуоресцентных зондов. Однако с точки зрения современных требований, предъявляемых к полимеразам, Taq-ДНК-полимераза обладает рядом недостатков. Фермент допускает