Дейтерий - меченный l-фенилаланин, продуцируемый штаммом Brevibacterium methylicum для медицинской диагностики — страница 6

  • Просмотров 413
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 195
    Кб

того, мы не исключаем возможность, что при ферментации без рН-статирования может происходить обратное превращение экзогенного фенилаланина в интермедиаторные соединения его биосинтеза [21]. При обсуждении механизма биосинтеза L-фенилаланина следует отметить, что он синтезируется в клетках микроорганизмов из префеновой кислоты, которая через стадию образования фенилпирувата превращается в фенилаланин под действием

клеточных трансаминаз [22] (схема 1). Данные тонкослойной хроматографии (ТСХ) и масс-спектрометрического анализа культуральной жидкости показали, что кроме L-фенилаланина данный штамм B. methylicum синтезирует и накапливает экзогенно другие аминокислоты: аланин, валин, лейцин, изолейцин. Эффективность использования дансильных и Z-производных аминокислот для масс-спектрометрических исследований была показана раннее [10, 16]. В данной

работе уровни включения изотопа 2Н в L-фенилаланин в составе культуральной жидкости определяли методом масс-спектрометрии электронного удара метилового эфира дансил-фенилаланина или в виде Z-производного фенилаланина после их препаративного разделения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ. Производные аминокислот при этом получали прямой обработкой препаратов культуральной жидкости дансилхлоридом (DnsCl) или

карбобензоксихлоридом (Zcl). Реакцию проводили в щелочной среде в водно-органическом растворителе в соотношении карбобензоксихлорид (дансилхлорид)-аминокислота, равным 2:1. Летучесть дансилпроизводных аминокислот при масс-спектрометрическом анализе повышали за счет дополнительной дериватизации по карбоксильной группе (этерификации) диазометаном. Выбор диазометана как этерифицирующего реагента был обусловлен

необходимостью проведения реакции в мягких условиях, исключающих изотопный (1Н-2Н) обмен в ароматических аминокислотах. В качестве примера на рисунке показана фрагментация метилового эфира дансилфенилаланина при электронном ударе. В масс-спектрах этого производного, как правило, четко детектируется пик молекулярного иона метилового эфира дансилфенилаланина М+. с m/z 412. Пик аминного фрагмента А имеет невысокую интенсивность, а

пик аминоацильного фрагмента В крайне низкую или вообще отсутствует (см. рис. 1). Кроме вышеобозначенных пиков, в масс-спектрах электронного удара Dns-Phe-OMe фиксируются пики с массовым числом m/z 250, 234, 170, которые соответствуют дансильному фрагменту и продуктам его распада до N-диметиламинонафталина . Масс-спектр фенилаланина, выделенный из культуральной жидкости, содержащей 98 об.% 2Н2О показан на рис. 4,б (спектр приведен относительно