Дейтерий - меченный l-фенилаланин, продуцируемый штаммом Brevibacterium methylicum для медицинской диагностики — страница 4

  • Просмотров 408
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 195
    Кб

префенатдегидратаза и дезоксиарабиногептулозофосфатсинтетаза (рис.1) [18, 19]. Определённый интерес в связи с этим представляет исследование способности продуцировать L-фенилаланин лейцинзависимым метилотрофным мутантом B. methylicum, достаточно удобным, хотя и малоизученным объектом для биотехнологического использования. Поэтому начальный этап биохимических исследований со штаммом метилотрофных бактерий B. methylicum был связан с

получением ауксотрофных мутантов, для которых в большинстве случаях характерны ограниченный спектр мутантных фенотипов и кроме того довольно высокий уровень реверсий [20]. Исходный L-лейцинзависимый штамм B. methylicum, продуцент L-фенилаланина был отобран в лаборатории генетики метилотрофов “ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов” на предыдущем этапе работы после обработки родительского штамма

нитрозогуанидином. Скрининг нужных клонов проводили по признаку устойчивости к аналогу фенилаланина - метафторфенилаланину (50 мкг/мл). Выделенные на селективных средах аналогорезистентные мутанты конвертировали метанол и накапливали при этом фенилаланин в ферментационной среде. Сравнительные анализы (ТСХ, МС) показали, что фенилаланин, продуцируемый данным штаммом метилотрофных бактерий полностью идентичен природному

L-фенилаланину. С целью увеличения эффективности изотопного мечения L-фенилаланина и интенсификации роста бактерий на полностью дейтерированной среде мы адаптировали полученный мутант B. methylicum к росту и биосинтезу в полностью дейтерированных средах. К данному штамму метилотрофных бактерий был применён специальный подход по адаптации (таблица), который заключался в серии из пяти адаптационных пассажей исходной культуры на

агаризованных средах (с добавкой 2 об. % C2HO2H) при ступенчатом увеличении концентрации тяжёлой воды в них (от 0; 24,5; 49,0; 73,5 об% до 98 об% 2Н2О). При этом последовательно отбирали отдельные колонии, выросшие на средах, содержащих дейтерий. Затем их пересевали на среды с большей степенью дейтерированности, включая среду с 98 об.% 2Н2О (степень выживаемости бактерий на конечной полностью дейтерированной среде составила 40%). Таблица. Изотопный

состав ростовых сред и биосинтетические характеристики B. methylicum Номер опыта Компоненты среды, об.% H2O 2H2O Метанол [U-2H] Метанол Лаг-период, ч Выход микробной биомассы, % от контроля Время генерации, ч 1 98 0 2 0 20 100 2.2 2 98 0 0 2 30 92.3 2.4 3 73.5 24.5 2 0 32 90.6 2.4 4 73.5 24.5 0 2 34 85.9 2.6 5 49.0 49.0 2 0 40 70.1 3.0 6 49.0 49.0 0 2 44 60.5 3.2 7 24.5 73.5 2 0 45 56.4 3.5 8 24.5 73.5 0 2 49 47.2 3.8 9 0 98.0 2 0 58 32.9 4.4 10 0 98.0 0 2 60 30.1 4.9 10’ 0 98.0 0 2 40 87.0 2.8 Кривые, отражающие динамики роста исходного и адаптированного к 2Н2О штамма B.