Дейтерий - меченный l-фенилаланин, продуцируемый штаммом Brevibacterium methylicum для медицинской диагностики — страница 3

  • Просмотров 407
  • Скачиваний 15
  • Размер файла 195
    Кб

воды [9]. Культивирование бактерий проводили на минеральной среде М9 [16], как описано в работе [9]. Получение дансиламинокислот культуральной жидкости. К 200 мг лиофилизованных препаратов культуральной жидкости в 5 мл 2 м. NaHCO3 (2 10-3 моль) рН 9-10 дробными порциями при перемешивании добавляли 320 мг (1,2 10-3 моль) дансилхлорида в 5 мл ацетона. Реакционную смесь выдерживали при перемешивании при 400 С в течении часа, затем подкисляли 2 м. раствором

HCL до рН 3,0 и экстрагировали этилацетатом (3 раза по 5 мл). Объединенный экстракт промывали водой до значения рН 7,0, сушили безводным сульфатом натрия, растворитель удаляли при 10 мм. рт. ст. Дансиламинокислоты в составе белковых гидролизатов B. methylicum получали как описано в работе [9]. Получение метиловых эфиров дансиламинокислот. К 20 мл 40 %-ного КОН в 40 мл эфира добавляли 3 г влажной нитрозометилмочевины и перемешивали на водяной бане

со льдом в течении 15-20 мин. После интенсивного газовыделения эфирный слой отделяли и промывали ледяной водой до рН 7,0, сушили безводным NaSO4 и обрабатывали им препараты дансилпроизводных аминокислот в составе культуральной жидкости и гидролизатов белка биомассы. Аналитическое и препаративное разделение Dns-Phe-OMe проводили методом обращённо-фазовой ВЭЖХ на жидкостном хроматографе “Knauer” (ФРГ), снабженным насосом “Knauer”,

УФ-детектором “2563” и интегратором “С-R 3A” (Shimadzy, Япония). Использовали неподвижную фазу: Separon SGX C 18, 7 мкм, 150 x 3,3 мм (Kova, Чехословакия). Элюирование проводили в системе растворителей: (А) - ацетонитрил-трифторуксусная кислота (20:80 об/об) и (В) - ацетонитрил. Использовали градиентное элюирование: от 20% В до 100%В в течение 30 мин, при 100% В в течение 5 мин, от 100% В до 20% В в течение 2 мин, при 20% В в течение 10 мин. Количественное определение

L-фенилаланина в культуральной жидкости проводили на приборе “Beckman DU- 6” (США) при 540 нм, после обработки препаратов культуральной жидкости нингидрином. Масс-спектры электронного удара получены на приборе “MB-80A” (Hitachi, Япония) при энергии ионизирующих электронов 70 эВ. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. Получение дейтерий-меченного [2H6]- L-фенилаланина и масс-спектрометрический анализ. Как известно, большинство микроорганизмов,

распространённых в природе не могут служить хорошими продуцентами аминокислот, вследствие наличия эффективных механизмов регуляции биосинтеза этих соединений в клетке, хотя эта способность проявляется у ряда их мутантных форм [17]. Активными микробными продуцентами L-фенилаланина являются, как правило, мутанты, у которых снят негативный контроль со стороны таких ключевых ферментов биосинтеза этой аминокислоты, как